分子克隆中使用的其他酶(续)

用T_4多核苷酸激酶标记DNA5′端: T_4多核苷酸激酶(T_4感染E.coli)此酶催化ATP之r位磷转移到DNA或RNA的5′OH上的反应。     

β-sheet类核酸结合结构域的作用原理

β-sheet类核酸结合域广泛存在于各种DNA特别是RNA结合蛋白中 ,参与生物体的各种基因调控 ,是一种重要的反式作用结构域 ,根据其基本的结构特征 ,可以推测其与多核苷酸链识别结合的作用机理。     

cDNA3′端代表差异显示分析

根据真核ｍＲＮＡ３′端一般含Ｐｏｌｙ（Ａ）的原理,可使用共同引物将不同的ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,然后设计特殊引物进行反转录ＰＣＲ,或者将限制性酶切与反转录ＰＣＲ偶联使用,均可获得对应于ｍＲＮＡ３′端的ｃＤＮＡ３′端代表扩增子。比较不同条件下的ｃＤ－ＮＡ３′端代表扩增子,可以获得两种或多种细胞中ｍＲＮＡ的表达差异谱,并分离、克隆差异表达的基因序列 。     

分子克隆中使用的其他酶(续)

核酸酶BaJ31: 此酶有以下两种活性:(1)高度专一的单链脱氧核糖核苷酸内切酶与外切酶活性,催化从双链DNA3′,5′两端切除寡核苷酸片段或单核苷酸的反应(DNA两条链的降解速度几乎是相同的)。(2)与核酸酶S_1相似的单链专一内切酶活性。     

反义基因治疗

除了反义核酸和核酶外,最近又发展了一种新型的反义药物———反义肽核酸(PNA)。反义治疗的经典策略是阻断异常基因的表达;随着研究的深入,又发现了以反义药物调整基因表达比例(即调控基因治疗)的反义治疗途径。本文对反义基因治疗的策略、反义药物的设计及稳定性等方面的新思路和该领域的发展与应用前景作了概括介绍。     

大肠杆菌可溶性核糖核酸结构的研究 Ⅰ.可溶性核糖核酸的结构分析和一种测定核苷酸分布的方法

(一)利用不同工具酶和化学因素对于核酸的特异降解作用,提出一种简便的系统分析S-RNA RNase I降解物的方法。方法共分四个步骤,连续在纸上进行,可以测定末端以及—PypCpNp—,—PypUpNp—,—PypApNp—,—PypGpNp—,—PupApNp—,—PupGpNp—,—PupCpNp—,—PupUpNp—在核酸链中的分布。(二)对大肠杆菌S-RNA的内部结构进行了分析,得到以下结论:(1)在S-RNA链中,嘧啶或嘌呤核苷酸有“成堆”的排列。属于这种排列的核苷酸,嘧啶占总嘧啶量的56.5%;嘌呤占总嘌呤量的56.4%。(2)S-RNA经RNase I降解后多核苷酸片段(Pup)_nPyp中,嘧啶端C>U,C/U比值为1.5;嘌呤端G>A,G/A比值为1.2。(三)大肠杆菌S-RNA根据本方法分析结果计算,由76±1核苷酸残基组成(未包括(?)Up),分子量约为25000±1000,与应用核碱组成分析计算的结果基本符合。(四)根据—PupCpNp—与—PypGpNp—以及—PupUpNp—与—PypApNp—的测定值基本相同一点,讨论了S-RNA双螺旋结构,核碱成G—C、A—U对排列的可能性。并估计在S-RNA链中,少数不成对排列的碱基,可能分布于嘧啶或嘌呤“成堆”的链节中。     

Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。     

天然高聚核糖核酸在溶液中的大分子结构

一、引言自从由烟草斑纹病毒(TMV)中分离出有感染性的核糖核酸(RNA)之后(Gierer 及 Schramm,1956;Fraenkel-Conrat,Singer 及 Williams,1957),首次说明了制备天然状态的自由高聚核精核酸的可能性。这就引起了这样一个问题:在溶液中这种天然 RNA 大分子的结构是怎样的。首先,似乎很可能分离出的病毒 RNA 在溶液中的天然构型和在完整的病毒中的是一样的。这是 Ginoza(1958)的主张。但是,后来的数据使得对溶液中感染性 RNA 的存在状态有了不同的看法。在溶液中,RNA 的多核苷酸链较其在病毒分子中时,     

一种DNA扩增的新技术： 利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应

Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用. 本文利用Bst DNA聚合酶的5′→3′聚合酶、核苷酸（末端）转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)．在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA|之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3′末端沿5′→3′方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸（dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1 与下游引物P2之间的缺口|然后,以下游引物P2为模板形成互补序列（RcP2）;接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3′末端,形成（dNMP)n序列．继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1|如此往复,形成［P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n …］序列．本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论．该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索．     

遗传工程术语解释(续)

最近邻分析法 确定多核苷酸链上与另一碱基对紧邻的某一特定碱基对出现的频率的一种生化技术。 缺口 DNA的单链断裂(利用脱氧核糖核酸酶和溴化乙锭处理DNA都能够形成缺口)。     

印度木薯花叶病毒DNA在寄主植物中可能存在的形式

从印度木薯花叶病毒（ＩＣＭＶ）侵染的植物中纯化特异的核酸,经ＲＮＡａｓｅ,ＤＮＡａｓｃ,Ｎｕｃｌｅ－ａｓｅＳｌ,ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅⅢ和ＥｃｏＲＩ酶切,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｄｏｔｂｌｏｔｓ杂交证实,在感病的植株中,存在两种形式的病毒核酸：环状双链ＤＮＡ和环状单链ＤＮＡ,后者可能是病毒ＤＮＡ的（－）链,环状双链ＤＮＡ经限制性内切酶作用可得２．７ｋｂ的线性双链ＤＮＡ纯化的病毒核酸含ＤＮＡ１和ＤＮＡ２两个分子量相近的组份。     

MicroRNA对动脉粥样硬化发生的调控作用及其临床应用

MicroRNA（miRNA）是新发现的基因表达调控因子,由长约21～25个核苷酸的单 链RNA分子构成,是非编码小RNA. 它可以通过与特定mRNA的3′非翻译区（3′- untranslated region,3′UTR）相结合,抑制mRNA编码蛋白质的翻译过程来调控基因表达. 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症性疾病,是多种心血 管疾病的病理基础.最近,研究发现多个miRNA与动脉粥样硬化的发生发展有关, 且其在血液和体液中稳定存在并高度保守. 本文主要综述了miRNA对动脉粥样硬化进程的调节作用及以其为靶点的相关临床研究,旨在阐明miRNA成为动脉粥样硬化诊断与治疗新靶点的重要意义.     

功能核酸纳米机器生物传感器的研究进展

功能核酸纳米机器是天然或人工设计的通过核酸碱基序列特异性相互作用而自组装形成的核酸组件。功能核酸纳米机器的运转可通过两种方式使其结构或构象发生转化而被激活,一种方式是功能核酸与特定信号分子相互作用使其结构发生变化;另一种方式是在外界环境的刺激下(如改变pH、加入离子、用不同的光照射等)使功能核酸构象发生变化。目前研究的主要有G-四链体功能核酸介导的、适配子功能核酸介导的、脱氧核酶介导的、霍利迪结功能核酸介导的、基于非金属、金属材料的、链置换的、点击反应的、三螺旋核酸的、pH响应的、光诱导的功能核酸纳米机器。综述了这些经典的功能核酸纳米机器的具体运作机理,讨论了在药物靶向递送、生物成像的应用研究中的实际意义及其存在的问题;展望了功能核酸纳米机器的应用前景及可能遇到的挑战。     

DNA5′端~(32)P标记方法

在DNA的结构与功能研究中,其5′端~(32)P标记是常用的有效技术。下面我们从《Methods in Enzymolgy》Vol 65中摘译了DNA 5′端脱磷及~(32)P标记方法,供大家参考。 1.用磷酸单酯酶除去DNA链5′末端磷     

细胞介导的免疫与中枢神经系统—γ干扰素的一个关键作用

<正>细胞表面存在两种不同类型的主要组织相容性复合体(MHC)糖蛋白,称为第一类(ClassⅠ)的强移植抗原和第二类(ClassⅡ)的Ia抗原。它们是不同功能的T淋巴细胞的靶分子。ClassⅠ糖蛋白由两条链组成:一条链45,000KDa,另一条链11,500KDa。较大的链在膜内有一恒定区,但在膜两侧区则呈高度的变异性,而较小的B_2—微球蛋白链具有高度的保守性。ClassⅡ由横跨胞膜的两条27—34,000KDa链组成。细胞毒T巴淋细胞(CTL)能清除病毒感染的细胞,并参与病毒性疾病的部份炎症过程。CTL特异识别病毒与Cl-     

中国汉族个体HLA-A、-B基因全长序列的测定及调控区多态性

文章利用20个中国汉族个体样本建立了稳定精确的HLA-A、-B基因全长序列的克隆测序方法, 获得HLA-A 10个等位基因4.2 kb序列, HLA-B 6个等位基因3.7 kb序列, 序列涵盖了两个基因的所有外显子、所有内含子、5′启动子区以及3′非翻译区(3′UTR)。A*1153是文章发现的一个新等位基因, B*151101的内含子序列、5个HLA-A以及2个HLA-B等位基因的5′启动子序列和3′UTR序列为国际上首次报道, 其他等位基因均延伸了IMGT/HLA数据库中释放的全长序列。文章首次在中国汉族个体中测定了IMGT/HLA数据库中没有覆盖的HLA-A、-B基因的上游5′启动子以及下游3′UTR区域的多态性模式。HLA-A基因5′启动子延伸区域共发现26个SNPs和一处3 bp(AAA/-)的插入/缺失, 3′UTR延伸区域共发现14个SNPs; HLA-B基因5′启动子延伸区域共发现5个SNPs和一处1 bp(T/-)的插入/缺失, 3′UTR延伸区域共发现8个SNPs。通过对两个基因的5′启动子、外显子以及3′UTR的系统发育树分析, 发现两个基因调控区与外显子的进化关系有所不同, HLA-A基因除A*24020101外, 其他等位基因两端调控区与外显子连锁比较紧密, HLA-B基因两端调控区与外显子之间则发生了较为频繁的重组事件。     

外切核酸酶Ⅲ介导的DNA分子克隆

DNA克隆技术,作为最基本的现代分子生物学实验技术之一, 已经成为生物医学研究领域的重要研究手段。传统的分子克隆方法需要经过限制性内切酶酶切和DNA连接酶连接的步骤,是否存在合适的酶切位点和DNA连接酶的效率成为影响克隆的重要限制因素。本文描述了一种由外切核酸酶Ⅲ介导的,以3′-5′外切核酸酶活性和细菌细胞内DNA修复机制为理论基础的DNA分子克隆方法,称为不依赖连接酶的分子克隆（ligation-independent cloning, LIC）|证明了该方法的高效性和可靠性,并进一步对酶的用量、反应温度、反应时间、片段载体比例和量等多个参数进行了优化,建立了一种快速、简便和高效的DNA克隆方法。     

多核苷酸的3′-端磷酰化

本文报导了一种使寡聚核苷酸3'-端磷酰化的新方法。其原理是用多核苷酸磷酸化酶(PNPase),使7-甲基鸟苷5'二磷酸(m~7GDP)在引物存在下聚合,然后在温和的化学条件下,选择性消去7-甲基鸟苷(m~7G)。我们应用两种三核苷二磷酸CpCpA,CpUpC作引物,结果成功地合成了两种三核苷酸CpCpAp,CpUpCp。此方法还可用于多核苷酸的3'-~(32)P标记。     

核酸体外扩增技术

核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展 ,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。根据其特点可分为两类 :一类是靶核酸的直接扩增 ,如聚合酶链式反应、链替代扩增、连接酶链式反应、核酸依赖的扩增、Qβ复制、转录介导的扩增和滚环扩增等 ;另一类是信号放大扩增 ,如支链DNA、侵染探针等。就现有的核酸扩增技术的原理、特点及应用进行介绍。     

多核苷酸的3′-端磷酰化

本文报导了一种使寡聚核苷酸3′-端磷酰化的新方法。其原理是用多核苷酸磷酸化酶(PNPase),使7-甲基鸟苷5′二磷酸(m~7GDP)在引物存在下聚合,然后在温和的化学条件下,选择性消去7-甲基鸟苷(m~7G)。我们应用两种三核苷二磷酸CpCpA,CpUpC 作引物,结果成功地合成了两种三核苷酸CpCpAp,CpUpCp。此方法还可用于多核苷酸的3′-~(32)P 标记。