人肌型和脑型肌酸激酶的提纯与性质的比较

本文报道人肌型和脑型肌酸激酶的提纯方法和某些性质的比较。两种同工酶的提纯倍数分别达30.7和110倍,活力回收为48.3%和26%,比活力为113.5和90单位/毫克蛋白。提纯酶制剂在醋酸纤维薄膜电泳酶活力鉴定,均可见一条萤光带,在聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白染色时,肌型为一条带,脑型为两条带。肌型和脑型肌酸激酶对底物ADP的k_m分别为0.5和0.25mM,对CrP的K_m分别为9.5和4.2mM。温度对它们影响的差别十分显著,将酶制剂在不同温度处理15分钟,在30～45℃间NMCK酶活力能保持在90%以上,而BBCK活力则呈直线下降。在45℃时BBCK则全部失活。如在37℃保温不同时间,MMCK保温8小时活力仍有80%,而BBCK半小时后活力即迅速下降,4小时后全部丧失。用碘代乙酸和酶作用时,发现两者活力均能显著被抑制。抑制作用在25分钟内均呈一级反应。但MMCK酶活力的半衰期为14分,而BBCK为5分。两种同工酶制剂在相似的蛋白浓度下随IAA浓度的增加MMCK的活力不能完全被抑制,而BBCK则可完全被抑制。ADP具有保护IAA抑制这两种同工酶酶活力的作用,但作用不完全相同。还比较了三种巯基化合物(DTT、巯基乙醇、CyS)对这两种同工酶的激活作用,发现这三种化合物对MMCK激活作用大于BBCK,尤以DTT为最显著。     

高粱NADP苹果酸脱氢酶的纯化及其分子特性

用Sephadex G-100柱和制备性等电聚焦电泳纯化了高梁叶片NADP苹果酸脱氢酶,得到电泳均一的酶制剂,酶比活力提高350倍。天然酶含有两个分子量为4万D的亚基。动力学研究表明Km(OAA)=31μmol/L:K_m(NADPH)=48 μmol/L;K_m(Mal)=11m mol/L:K_m(NADP)=45μmol/L。NADP为NADPH的竞争性抑制剂,抑制常数K_i=190 μmol/L。 在体外DTT为NADP苹果酸脱氢酶的激活所必需。DTT对该酶的激活受一小分子蛋白、NADP及离子强度所调节。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的提纯和性质的研究

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)209产生的胞外碱性蛋白酶的粗酶制剂(5×10 4u／g),经硼砂NaOH缓冲液抽提,硫酸铵沉淀,Sephadex G一25脱盐,DEAE-纤维素柱层析,冷冻干燥获得部分纯化的酶。纯酶的活力为199x10u/g,比活力提高2,6倍。此酶的最适pH8．5—9．0,在pH6一10之间稳定,因此是属于微碱性蛋白酶“’。最适温度为50℃,在50℃以下稳定,在60℃处理10分钟活力损失95％。0.003村c丑件的存在对酶的热稳定性和pH稳定性均有显著提高。Ag+,Cu2+,Fe2+,Hg+,Zn2+ 对酶有抑制作用;Mn2+有明显的激活作用;1×10-3M的PCMB,IAA,O-PTH,PMSF对活力无影响;1×10-3M EDTA对酶有30％的抑制作用;在40℃用NBS(1×10-4M)、DFP(2．5mM)对醢进行10分钟处理,酶活力完全损失。此酶能水解多种天然蛋白,如酪蛋白、血红蛋白、蛇毒蛋白等,不水解鱼精蛋白和溶菌酶。以酪蛋白为底物测得的km值为0．66×10-2g／ml。在pH7．3进行圆盘凝胶电泳,虽然呈现九条带,但均具有大小不等的蛋白酶活力。     

猪L型、R型丙酮酸激酶同工酶动力学的进一步研究

本文对纯化的猪L型、R型丙酮酸激酶(PyK)同工酶的效应剂动力学作进一步研究。结果如下:1.FDP能激活两型PyK同工酶,使两型PyK对PEP的正协同别构效应降低(n_H减小),亲和力增高(S_(0.5)降低)但不影响两型PyK对ADP的Km。2.Mg~(++)对两型PyK同工酶也有相似的激活作用。3.丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸及ATP对两型PyK均有抑制作用,两酶相应的抑制百分率无显著差异。三种氨基酸均为两型PyK底物PEP的K型抑制剂,ATP则为两型PyK底物PEP的V型抑制剂。4.上述三种氨基酸对L型和R型PyK的抑制均呈别构负协同动力学。n_H均小于1,两型PyK相应的抑制常数K_i比较接近。还对PyK加热后的脱敏及PyK的反应机制作了探讨。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅱ.丙酮酸激酶同工酶与克奈特瑞效应的关系

本文用免疫测定法发现,在Hep A腹水肝癌(简称Hep A)中,丙酮酸激酶(PyK)同工酶谱发生明显改变。正常小鼠肝以L型为主,K型只占总活性的20%。饥饿24小时后,L型活性降低,以致K型相对增高至30%左右。在Hep A中,不论饥饿与否,K型PyK要比正常小鼠肝的活性高出20余倍,占总活性的90%以上。L型PyK对ADP表现为米孟氏动力学,S_(0.5)=2.865mM;而Hep A的K型PyK对ADP则呈正协同的别构动力学,Hill氏系数=1.40,S_(0.5)=0.741mM。故K型PyK对ADP的亲和力大于L型PyK。并且K型PyK较L型PyK不易受其产物ATP的反馈抑制,因而大大地增强了Hep A胞液中的K型PyK同线粒体争夺ADP的能力。PyK同工酶谱的改变和这两型PyK动力学上的差别,很可能是癌瘤中出现克奈特瑞效应的又一重要机理。不论在正常小鼠肝还是Hep A中,3-磷酸甘油酸激酶(3PGAK)的总活性均高于PyK,3PGAK不是酵解通路的限速酶。Hep A中3PGAK的活性仅比正常的高出0.7倍,未肯定有同工酶,所以它和癌瘤中出现的克奈特瑞效应关系不大。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅱ.丙酮酸激酶同工酶与克奈特瑞效应的关系

本文用免疫测定法发现,在Hep A 腹水肝癌(简称Hep A)中,丙酮酸激酶(PyK)同工酶谱发生明显改变。正常小鼠肝以L 型为主,K 型只占总活性的20%。饥饿24小时后,L 型活性降低,以致K 型相对增高至30%左右。在Hep A 中,不论饥饿与否,K 型PyK 要比正常小鼠肝的活性高出20余倍,占总活性的90%以上。L 型PyK 对ADP 表现为米孟氏动力学,S_(0.5)=2.865mM;而Hep A 的K 型PyK 对ADP 则呈正协同的别构动力学,Hill 氏系数=1.40,S_(0.5)=0.741mM。故K 型PyK 对ADP的亲和力大于L 型PyK。并且K 型PyK 较L 型PyK 不易受其产物ATP 的反馈抑制,因而大大地增强了Hep A 胞液中的K 型PyK 同线粒体争夺ADP 的能力。PyK 同工酶谱的改变和这两型PyK 动力学上的差别,很可能是癌瘤中出现克奈特瑞效应的又一重要机理。不论在正常小鼠肝还是Hep A 中,3-磷酸甘油酸激酶(3 PGAK)的总活性均高于PyK,3PGAK 不是酵解通路的限速酶。Hep A 中3PGAK 的活性仅比正常的高出0.7倍,未肯定有同工酶,所以它和癌瘤中出现的克奈特瑞效应关系不大。     

嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质

对嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilis)WF146的产蛋白酶的条件进行了研究,在58℃条件下,WF146在pH值为75的Fd培养基中振荡发酵培养48h后,发酵液中高温蛋白酶产量可达600u/mL以上。对该酶性质的研究表明,酶分子量为34kD,最适作用pH为80,最适作用温度为80℃,具有良好的pH稳定性及热稳定性。Ca2+对该酶的稳定性具有重要影响,PMSF、DFP及IAA能强烈抑制酶活力,而DTT对该蛋白酶活力无影响     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究 Ⅰ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含DNase、RNase 和蛋白酶活力,无内源DNA。测定了 RNA 聚合酶A和C对α-鹅膏荤碱的敏感性。酶A在α-鹅膏荤碱为400μg/ml时,活性受到抑制,而酶C在该浓度时,几乎不受抑制。(NH_4)_2SO_4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40mM和240mM。无二价金属离子Mn~(2+)或Mg~(2+),酶A和C几乎无活力。两种酶最适Mn~(2+)浓度均为2.5mM,Mg~(2+)浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

热处理对参与西兰花叶绿素降解的过氧化物同工酶活性的影响

为了揭示热处理对参与西兰花(Brassica oleracea L.)叶绿素降解的过氧化物同工酶活性的影响,通过分子排阻色谱法检测涉及叶绿素(Chl)降解的3种过氧化物同工酶Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型的变化,同时讨论热处理和放线菌酮对酶活性的影响。结果显示,未经热处理的西兰花小花的叶绿素a和叶绿素b含量在16℃下2d后显著下降,而经热处理的小花中的含量(50℃下1.5h)几乎没有变化。新鲜西兰花小花中可检测到Ⅰ型,并且其在未经热处理的西兰花中的活性随着储存时间显著增加。而热处理抑制了所有异构过氧化物酶活性的增强。放线菌酮处理也有效地阻止Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类过氧化物酶活性的增加,同时抑制小花变黄。与Ⅰ型相比,Ⅱ型和Ⅲ型在Chl a上表现出更低的K_m和更高的V_(max)/K_m值。这表明Ⅱ型和Ⅲ型都可能与西兰花小花中的Chl降解密切相关,并且热处理可能通过抑制异构过氧化物酶活性来抑制小花衰老。     

天花粉过氧化物酶的提纯及其同工酶组成测定

本文介绍从新鲜天花粉块根榨汁中发现有14种碱性和酸性过氧化物酶并进行了提纯,同时,对提纯的碱性和酸性天花粉过氧化物酶制剂的同工酶组成进行了鉴定。     

天花粉过氧化物酶的提纯及其同工酶组成测定

本文介绍从新鲜天花粉块根榨汁中发现有14种碱性和酸性过氧化物酶并进行了提纯,同时,对提纯的碱性和酸性天花粉过氧化物酶制剂的同工酶组成进行了鉴定。     

吲哚乙酸对向日葵黄化幼苗下胚轴切段钾离子吸收的调节

IAA处理经适应性老化后的向日葵6～7日黄化幼苗的下胚轴切段,能显著促进它们的K~ 吸收和H~ 分泌。钒酸钠处理强烈地抑制K~ 吸收和H~ 分泌。IAA处理不改变K~ 吸收的V_(max)而使K_m明显变小。IAA处理显著促进在去离子水中的向日葵下胚轴切段的呼吸。KCl单独处理以较小的程度促进呼吸。IAA与KCl共同处理对呼吸的促进作用分别大于单独用IAA或KCI处理的促进作用,但小于这两个单独处理的促进作用之和。IAA促进的K~ 吸收并没有引起呼吸的进一步增加。IAA预处理向日葵下胚轴使从中提取的富含质膜制剂的K~ 刺激的ATP酶活力提高44.0％。在未经IAA预处理的富含质膜制剂中加IAA,K~ 刺激的ATP酶活力提高48.7％。IAA可以直接在质膜水平上促进向日葵下胚轴的质膜K~ 、Mg~(2 )—ATP酶活力。     

弗氏柠檬酸细菌完整细胞TNT降解酶的性质

弗氏柠檬酸细菌(Cizrobacter freundii)在好氧和兼性好氧条件下具有很强的降解2,4,6-三硝基甲苯(a-TNT)的能力。该菌在牛肉汁培养基中30℃摇床培养10小时,其完整细胞TNT降解酶活力最高。酶反应最适pH为7．2,最适温度为30℃,酶的pH和温度稳定性较佳,在PH 6.0--8.0时,30℃保温12小时,保留活力90％以上,30小时仍有76％剩余活力。作用于a—TNT的米氏常数(Kin)为5印^f,最大反应速度(Vmax)为0．22／zM／mg蛋白／,J、时。金属离子“g’、Hg冲和。U蚌对酶活力有强烈抑制作用,EDTA无明显抑制。底物类似物间一二硝基苯、2,4-二硝基苯酚和对硝基酚(0.3mM)对酶活力也有一定程度的抑制作用。     

ATP对菠菜二磷酸核酮糖羧化酶的热稳定作用

纯化的菠菜RuBP羧化酶有热易变性。加入ATP对RuBP羧化酶的热失活有明显的保护作用。如同时加入DTT则可进一步提高ATP对酶的热稳定作用。此外,ADP,AMP和无机磷也有热稳定作用,但效果比ATP差。照光叶子的ATP含量比暗处理的叶子高一倍,而其RuBP羧化酶粗提液在60℃保温后的酶蛋白含量及酶活力分别比暗处理的高3至7倍。如果在暗处理的RuBP羧化酶粗提液中加入外源ATP时,则酶的热稳定性可达到光处理的86％。     

大鼠再生肝中蛋白二硫还原酶的提纯及性质的初步研究

本文报告在大鼠组织中存在有促使肝蛋白—S—S—还原为蛋白—SH的酶活力,而以再生肝、肝癌、小鼠胚胎等组织的活力为高。利用硫酸铵分步沉淀及DEAE-纤维素吸附等法,可将再生肝中酶活力提纯约200倍,并可与谷胱甘肽还原酶活力完全分开。酶活力需要NADPH或NADH作为供氢体。最适pH为7.5。受Cu~(++)、Zn~(++)、Hg~(++)、对氯汞苯甲酸、一代碘乙酸等物质抑制。谷胱甘肽对酶活力无激活作用。提纯酶制剂不含有还原小分子—S—S—化合物的活力,对一些含—S—S—链的结晶蛋白质也无活力。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

变色栓菌锰过氧化物酶同工酶的纯化及其性质研究

变色栓菌(Trametes versicolor)胞外产酶培养液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析后,获得两个活性组分D1和D2,其中活性组分D2经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析后,所得样品MnP1经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。活性组分D1经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析后,所得样品MnP2经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。两种同工酶MnP1及MnP2,各自的比活力为579.09、425.00U/mg;纯化倍数为17.51、12.85;活力回收率为6.17%、2.47%。由SDS-PAGE法测得MnP1及MnP2的表观分子量分别为46.3kD、43.0kD。两种同工酶催化DMP(2,6-二甲氧基酚)氧化反应的最适pH值及最适反应温度有所不同,最适pH值分别为pH5.8、pH6.2,最适反应温度分别为60℃、65℃。在45℃以下,pH4.0~7.0之间,MnP1及MnP2的稳定性好。DMP为最佳酶促反应底物,以DMP为底物的Km分别为13.43μmol/L、12.45μmol/L。在无Mn2 存在的条件下,酶促反应几乎不发生。EDTA在较高浓度时抑制酶的活性,DTT在所试浓度下都完全抑制酶的活性。     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

猪骨骼肌磷酸葡萄糖异构酶的提纯及性质研究

本文报道猪骨骼肌磷酸葡萄糖异构酶（ＧＰＩ．ＥＣ ５．３．１．９）的提纯及其性质。设计了四步提纯法（稀盐溶液抽提、有机溶媒沉淀、透析、葡聚糖Ｇ－１００柱层析），对猪的五种不同解剖部位的骨骼风进行了ＧＰＩ的提纯。结果均得到聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）图谱为一条带的产品。提纯效果以猪股二头肌为例：提纯１０．６８倍、活力回收３２．３７％，比活力１．６×１０５单位。对提纯酶性质的研究表明；猪肌提纯的ＧＰＩ由三个亚基组成。分子量约为１２０Ｋｄ，等电点为 ６． ６，最适ｐＨ８．５，最适温度 ３５℃，米氏常数：６．０２ｍｍｏｌ／Ｌ，活化能为３２３７８．４焦耳／Ｋ，ｍｏｌ。免疫电泳实验证实猪肌提纯酶具抗原性。其免疫血清与自牛、兔、鸡、鱼的骨骼肌用同法提纯的ＧＰＩ有交叉免疫反应。免疫血清且对原酶液有抑制作用。猪肌ＧＰＩ与其它数种动物肌肉之ＧＰＩ的ＰＡＧＥ行为、混合电泳行为，等电聚焦行为、氨基酸组成等各方面基本相同，可以认为这是猪肌ＧＰＩ与其它数种动物肌肉的ＧＰＩ为同源蛋白质的佐证。     

产碱菌外切异麦芽三糖水解酶的产生和性质

从污染的右旋糖酐溶液中分离出一株外切异麦芽三糖水解酶(Exo-isomaltotrio-hydrolase,1,6-α-D-Glucan isomaltotriohydrolase EC 3.2.1.95)产生菌,经鉴定为产碱菌(Alcaligenes sp.).研究了酶的产生条件和基本性质.产酶最适培养基组成(%):右旋糖酐1.5、鱼粉蛋白胨1、酵母抽提物0.1、牛肉膏0.3、甲醇2,pH8.0,250ml三角瓶中装20ml培养基,于26℃200r/min旋转摇床上振荡培养48小时.酶的最适作用温度和pH分别为50℃和p H6.5—7.5,在pH5.0—10.6范围内稳定.在40℃保温24小时酶活力基本不变,50℃保温8小时剩余酶活力为71.8%,保温24小时剩余酶活力为44.2%,在55℃酶活力的半寿期为10 小时.金属离子Hg^(2+)、Ag^+对酶强烈抑制.水解右旋糖酐的终产物为异麦芽三糖,酶的作用方式为外切型.