2,5-DKG还原酶I的分离纯化与性质研究

欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)还原酶I基因,5 L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶I,纯化了5倍,得率27%,比活力为3,418 U/mg。测定了该酶的一些特性参数:分子量为34 kD,等电点为6.0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙酸(2-KLG),对NADPH和2,5-DKG底物的Km值分别是0.29mmol/L和14.7 mmol/L,1 mmol/L Cu2 、Zn2 等有强烈抑制作用,EDTA和巯基乙醇对该酶没有抑制作用,酶的最适pH为7.0,最适反应温度为40℃。     

2,5-DKG还原酶Ⅰ的分离纯化与性质研究

欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（2,5-DKG）还原酶Ⅰ基因,5L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE—Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶Ⅰ,纯化了5倍,得率27％,比活力为3,418U／mg。测定了该酶的一些特性参数：分子量为34kD,等电点为6．0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）,对NADPH和2,5-DKG底物的Km值分别是0．29mmol／L和14．7mmol／L,1mmol／L Cu^2＋、Zn^2＋等有强烈抑制作用,EDTA和巯基乙醇对该酶没有抑制作用,酶的最适pH为7．0,最适反应温度为40℃。     

棒状杆菌2，5-DKG还原酶基因在欧文氏菌中的表达

将能够在大肠杆菌内高效表达棒状杆菌2,5-DKG还原酶I基因的质粒pBL4改造成为具有链霉素抗性的质粒pBLS,采用改进的感受态转化法将pBLS导入能够利用葡萄糖高产2,5-DKG的欧文氏菌SCB125中,通过提高温度诱导,经SDS-PAGE分析2,5-DKG还原酶I获得了高效表达,占菌体总蛋白的22%,不形成包涵体。体外酶活测定结果表明表达的酶具有较高的活力。同时,通过凝胶活力染色发现了宿主欧文氏菌SCB125中存在一个活力较强的2-酮基醛糖还原酶。     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达*

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一     

棒状杆菌2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆与表达

从棒状杆菌(Corynebacterium sp.SCB3058)初步纯化得到两个2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5 DKG)还原酶,在此基础上利用PCR技术,以基因组DNA为模板,扩增得到含有2,5-DKG还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到PGEM3Zf(+)并转化大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆pGEM813.序列分析表明,片段全长1107bp,含有一个834bp的开放阅读框架,编码产生由278个氨基酸组成的分子量为34kD的蛋白.将目的基因的调控序列进行缺失突变后,克隆到原核表达载体pBL上获得表达质粒pBL4.通过温度诱导,经SDS-PAGE分析有明显的表达条带,约占菌体总蛋白的20%,并且表达的蛋白具有较高的酶活力.构建的优良基因工程菌为最终实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸打下了基础.     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基,终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此,重新设计和合成了PCR引物,并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。     

人β-干扰素粗制品的浓缩与纯化

本文报道了采用Millipore超滤膜浓缩人β-干扰素粗制品,滤速快,活性回收率高,同时又具有一定的纯化作用。浓缩后的干扰素样品,再经过一次蓝色葡聚糖——Sepharose CL-6B柱层析,可将其纯化2800倍,特异活性可达10⁶μ／mg蛋白以上的国际临床标准。     

锡尾矿链霉菌AE21985代谢产物的分离与鉴定

采用硅胶柱、凝胶柱层析、高效液相制备等方法从分离自云南锡尾矿土壤的链霉菌AE21985发酵液中分离到19个化合物,通过波谱学方法鉴定为11个环二肽类化合物:3-(4-羟基苄基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮(1)、(3S,6S)-3-((R)-仲-丁基)-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(2)、(3S)-3-苄基哌嗪-2,5-二酮(3)、(3S,6S)-3-(2-甲基丙基)-6-(丙-2-基)哌嗪-2,5-二酮(4)、3-异丁基六吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(5)、(3S,6S)-3-((R)-仲-丁基)-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(6)、(3S,6S)-3-异丙基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(7)、(3S,7R,9S)-7-羟基-3-异丁基六吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(8)、3-(1H-吲哚-3-基甲基)-6-(丙-2-基)哌嗪-2,5-二酮(9)、(3S,8a S)-3-(丙-2-基)六氢吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(10)及(3S,6S)-3-苄基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(11);5个酰胺类化合物:(2E)-3-苯基丙-2-烯酰胺(12)、3-苯基丙酰胺(13)、2-苯基乙酰胺(14)、苯甲酰胺(15)及3-(1H-吲哚-3-基)丙酰胺(16);1个生物碱类物质:1H-吲哚-5-甲醛(17);2个核苷类物质:尿苷(18)及胸腺嘧啶(19)。这些化合物均为首次从该菌株中发现。     

仓鼠肝谷胱甘肽过氧化酶的提纯与鉴定

用硫酸铵分级沉淀后,经过Phenyl-sepharose CL-4B和DEAE-SephadexA-50柱层析分离得到了比活为1993units/mg、纯化倍数为443倍、产率为12％的仓鼠肝谷胱甘肽过氧化酶。提纯的酶在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带。     

大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶110位天冬酰胺突变后的结构与功能

3-酮基脂酰ACP还原酶催化3-酮基脂酰ACP还原为3-羟基脂酰ACP,是细菌脂肪酸合成反应的关键酶之一.为了明确该酶中110位的保守天冬酰胺残基在酶催化活性和酶结构中的作用,本研究采用基因定点突变和蛋白质表达纯化技术,获得了大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶FabG的两个突变蛋白：FabG N110Q和FabG N110L.圆二色谱结果显示,天冬酰胺残基的突变改变了FabG的空间结构,使突变蛋白的α螺旋结构明显增加.以3-酮脂酰ACP为底物的酶活性测定表明,突变蛋白的酶活性均有下降,但残存的酶活性达到了FabG的75%以上.突变蛋白FabG N110Q和FabG N110L具有3-酮基脂酰ACP还原酶的活性,能在体外重建细菌脂肪酸合成反应.对fabG温度敏感突变株的遗传互补分析表明,FabG蛋白110位天冬酰胺突变为谷氨酰胺或亮氨酸后,在一定的条件下仍能互补大肠杆菌的生长.本研究结果提示,FabG 110位的天冬酰胺残基不是参与3-酮基脂酰ACP还原酶催化反应的必需氨基酸,它只是作为结构氨基酸,在维持FabG的空间结构的稳定性方面起作用.     

酵母3-脱氧葡糖醛酮代谢酶的分离纯化及部分性质

3-脱氧葡糖醛酮 ( 3- deoxyglucosone)是美拉德反应的主要中间产物 ,对生物体具有毒性作用 .用硫酸铵分部沉淀、DEAE- cellulose52、Hydroxyapatite、DEAE- Sepharose CL- 6B柱层析从酿酒酵母 YBr-M( S.cerevisiae YBr-M)抽提液中分离纯化了 3-脱氧葡糖醛酮代谢酶 (以 NADPH为辅酶 ) .该酶是单一的分子 ,分子量为 44k D,反应最适 p H为 7.0 ,p H6.0～ 8.0之间酶活性相对稳定 ,以 3-脱氧葡糖醛酮为底物的米氏常数 Km 为 2 .2 5mmol/ L.在 35℃以下保温 30 min酶活不变 ,50℃保温 30 min后酶活损失 50 % .该酶对二羰基化合物的活性较高 ,对单羰基化合物则较低 ,其催化作用受碘乙酸、N-乙基顺丁烯二酰亚胺的抑制 ,而被β-巯基乙醇、二硫苏糖醇激活 ,催化作用必须以 NADPH为专一辅酶 ,当用 NADH代替 NADPH时 ,活力只有 5.3% .     

蛹虫草培养液成分研究

目的：研究蛹虫草培养液的化学成分。方法：采用硅胶柱色谱等技术分离纯化单体化合物,并根据理化性质及光谱数据鉴定结构。结果：分离并鉴定了8个化合物,分别是2-乙基-3-羟基4H吡喃酮（1）、1-甲酰基-苯并咪唑（2）、3-乙基-4-羟基-6-甲基．2H．吡喃-2-酮（3）、1-甲基-6-异丁基-2,5-哌嗪二酮（4）、1-异丙基-6-异丁基-2,5-哌嗪二酮（5）、3,6-二（对羟基苄基）-2,5-哌嗪二酮（6）、1-羟甲基-6-异丁基-2,5-哌嗪二酮（7）、麦角甾-7-22-二烯-3β,5α,6β-三醇（8）。结论：化合物1-5,7为首次从虫草属真菌中分离得到。     

云芝菌丝体多糖的分离纯化研究

利用热水抽提从云芝菌丝体中提取胞内多糖,初步纯化后,用DEAE-Sepharose CL-6B进行分离,从中分离出两个带电荷多糖组分即CVP-I和CVP-Ⅱ,对这两个组分分别用Sepharose CL-6B凝胶柱层析进行纯度鉴定,均出现单一峰,然后用紫外扫描发现这两个组分均出现蛋白多糖的特征吸收,从而可以判断这两个组分是蛋白结合多糖。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究——Ⅱ.2,5-DKG产酸菌株发酵条件

本文研究了D-葡萄糖两步串联发酵中前一步菌株的发酵产酸条件。实验结果表明,在含有D-葡萄糖、适量的玉米浆、碳酸钙和磷酸盐的培养基中,摇瓶培养48小时,一株葡萄糖酸杆菌突变株SCB611可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸25—30mg/ml,克分子转化率为25%左右;另一株欧文氏菌突变株SCB247可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸45—50mg/ml,克分子转化率为40%。随发酵时间适当延长,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸可逐渐增高。温度28℃,种龄15小时,接种量10%及良好的通气条件,有利于菌株产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸。     

醇醛脱氢酶的分离纯化及其基因文库的构建和筛选

在维生素C的发酵生产过程中,普通生酮基古龙酸菌S2(Ketogulonigenium vulgare)能产生醇醛脱氢酶,将L-山梨糖转化为VC的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。通过超声波破碎菌体、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,QSepharose High Performance柱层析等过程,从普通生酮基古龙酸菌S2发酵液中分离纯化了醇醛脱氢酶,并用该纯化酶免疫新西兰兔制备出了合格抗血清。同时,普通生酮基古龙酸菌S2基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切后,与黏粒载体pKC505连接,用包装蛋白进行包装,转染大肠杆菌DH5浕,构建了基因组文库。最后应用免疫酶斑点技术(Dot-ELISA)从12000个克隆子中筛选得到一个阳性克隆K719#。通过检测该基因工程菌的活性,表明K719#具有使L-山梨糖转化为2-KLG的功能,从而使醇醛脱氢酶在大肠杆菌中获得了高效表达,这为简化VC的生产工艺奠定了基础。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。     

D-葡萄糖串联发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺条件

研究了在10L发酵罐中D-葡萄糖串联发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的发酵工艺条件。第一步发酵采用欧文氏菌(Erwinia sp.)的突变株SCB247,培养36小时,可将D-葡萄糖转化成中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,在发酵液中约累积180mg/ml。第二步发酵采用棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058,可将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸专一性地还原生成2-酮基-L-古龙酸。在细胞生长进入对数生长期后期时,加入经十二烷基硫酸钠处理的第一     

脑啡肽基因的合成——Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成和三个片段,然后由脱去5'-Dmt基后依次同和向5'端延伸缩合得到产物和是通过和分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3'-OH进行磷酰化得到。则是由同反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短柱层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5'-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

海藻中两种纤溶活性化合物的分离与结构鉴定

采用氯仿-甲醇有机溶剂提取、常压硅胶柱层析等方法进行分离纯化,从微劳马尾藻的提取物中分离纯化了6个化合物;根据核磁共振谱分析及文献解析化合物B、D分别确定为棕榈酰基．油酰基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基甘油和肉豆蔻酰基-油酰基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基甘油;使用酶标仪体外测定化合物的纤溶活性,发现化合物B使纤溶作用提高了10％～30％,化合物D的纤溶促进作用弱于化合物B;分离纯化的纤溶促进化合物B和D属于甘油糖脂类化合物。本文首次从微劳马尾藻分离得到了肉豆蔻酰基．油酰基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基甘油。