昆虫蜕皮激素生物合成及其神经肽调控

蜕皮激素是对节肢动物体内类固醇激素的统称,昆虫的蜕皮激素主要由内分泌器官前胸腺合成,具有诱发幼虫周期性蜕皮以及最终变态蜕皮的生理功能。近期的研究工作阐明了前胸腺中原先被称为"黑箱"的一系列酶促反应步骤,此外促前胸腺激素受体的成功鉴定使人们对PTTH信号转导通路调控前胸腺蜕皮激素合成有了更深入的理解。     

Cathepsin L在鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡中的作用

目的:研究Egr-1对Cathepsin L的调控在鱼藤酮(Rotenone)诱导的多巴胺能神经元PC12凋亡的作用,初步探讨Egr-1与Cathepsin L的关系及机制。方法:常规培养PC12细胞,分别取1μM,2μM的Rotenone处理,用倒置显微镜观察细胞的形态变化;确定敏感性最强的浓度后再在不同的时间点下用Western blotting检测Egr-1、Cathepsin L蛋白表达情况;采用Egr-1si RNA转染PC12细胞,空载体siVector转染PC12细胞,Hoechst染色法检测细胞凋亡,Western blotting检测各处理组中Egr-1、Cathepsin L蛋白的表达情况。结果:Western blotting结果显示,经Rotenone刺激过的PC12细胞在2μM的浓度下最敏感,其Egr-1和Cathepsin L蛋白的表达量显著增加,且Egr-1在15 min就有明显的增加,而Cathepsin L在30 min才明显增加,说明Egr-1的确是出现在Cathepsin L蛋白的上游;Egr-1siRNA转染的PC12细胞的Cathepsin L表达量明显低于于空载体转染PC12细胞。结论:多巴胺能神经元PC12在Rotenone刺激下,细胞内Cathepsin L的表达与细胞内Egr-1蛋白水平有关,并且在抑制Egr-1的表达后,细胞内Cathepsin L的表达也相应的降低。所以我们得出Egr-1对Cathepsin L可能有调控作用,从而来调控多巴胺能神经元的凋亡。     

棉铃虫组织蛋白酶B酶原在毕赤酵母中的表达

棉铃虫组织蛋白酶B（ Helicoverpa armigera Cathepsin B ,HCB）属于半胱氨酸蛋白酶类,参与胚胎发育中卵黄蛋白水解供给胚胎发育的氨基酸。本研究将HCB基因克隆到pPIC9K载体并转化毕赤酵母KM71菌株,经甲醇诱导,HCB表达并分泌到培养上清中。表达产物经SDS-PAGE测定分子量为38 kD, 与HCB基因编码的蛋白质分子量一致。用HCB的特异性抗体检测表明重组表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B,原位水解实验显示重组表达的蛋白酶具有蛋白水解活性,表明在毕赤酵母中表达了有活性的棉铃虫组织蛋白酶B, 可用于组织蛋白酶B酶原活化机理研究及开发新蛋白酶产品。     

棉铃虫组织蛋白酶B组织分布与合成部位的研究

蛋白酶是指裂解肽链的所有酶类 ,根据作用位点的催化基团将蛋白酶分为 4大类 ,即丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶 (ＣｙｓｔｅｉｎｅＰｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ,ＣＰ)、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。每一大类又包括多种不同的蛋白酶 ,其中半胱氨酸蛋白酶是一类细胞内蛋白酶 ,包括组织蛋白酶Ｂ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｔ等 ,其活性中心含有活性必需的半胱氨酸残基 ,细胞内高度的还原环境对它们的作用非常重要 (Ｔｕｒｋ＆Ｂｏｂｔ,1991)。蛋白酶参与多种生理、病理性蛋白水解 ,在昆虫中的分布和功能也有报道 ,如蚊子卵中含有组织蛋白酶Ｂ ,参与胚胎发…     

棉铃虫章鱼胺受体2基因的分子鉴定

【目的】为了探讨章鱼胺受体2基因(Octopamine receptor 2,OA2B2)在棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)体内表达谱及激素对其调控作用,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用,开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。【方法】本实验采用QRT-PCR技术、激素处理、RNAi介导的蜕皮激素相关核受体沉默等方法对Ha OA2B2受体基因在棉铃虫不同发育阶段及组织中的表达谱与激素调控进行探究。【结果】生物信息学分析表明,Ha OA2B2受体基因编码框长度1 191 bp,编码396个氨基酸。Ha OA2B2受体基因氨基酸序列与家蚕Bombyx mori一致性高达89%。Ha OA2B2受体基因在棉铃虫各时期均有表达,尤其在5龄第3天转录水平达到最高;Ha OA2B2受体基因在棉铃虫幼虫头部表达量最高。蜕皮激素可促进Ha OA2B2受体基因的表达。【结论】分析了该基因的序列特征和表达谱,蜕皮激素对其表达量的影响,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用以及开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。     

蜕皮激素对昆虫生长及生殖过程的调控

蜕皮激素、保幼激素及神经激素在调节昆虫生长及生殖方面起到重要的作用。本文从蜕皮激素的合成过程、其活性形式20羟基蜕皮酮的作用模式、蜕皮激素与保幼激素的相互调节机制这三个方面综述了蜕皮激素在昆虫生长及生殖过程中的调控作用。     

昆虫蜕皮激素信号转导途径研究进展

蜕皮与变态是全变态昆虫典型的发育特征。调控昆虫蜕皮与变态的激素主要有蜕皮激素和保幼激素。目前已经阐明了蜕皮激素的核受体EcR及部分核信号转导途径,但蜕皮激素是否存在膜受体及膜信号转导途径研究很少。研究证明,蜕皮激素存在细胞质中的信号转导分子和途径,蜕皮激素通过NTF2和Ran调控EcR入核启动基因转录。蜕皮激素使细胞质中的热休克蛋白Hsc70部分入核与USP结合启动基因转录。蜕皮激素通过蛋白激酶PKC使伴侣蛋白calponin磷酸化,参与蜕皮激素信号途径的基因转录。这些研究结果说明蜕皮激素除了有核受体和核受体信号转导途径外,还存在细胞膜受体和细胞膜信号转导途径。     

蜕皮激素对家蚕卵黄原蛋白基因表达的调控

蜕皮激素（20-hydroxy ecdysone,20E）是由前胸腺分泌的能调节节肢动物昆虫纲、甲壳纲等动物蜕皮的激素. 家蚕属于完全变态昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育时期. 20E在家蚕发育过程中有不可替代的作用. 本研究通过酶联免疫吸附反应（ELISA）测定家蚕变态期前后血淋巴中20E滴度,发现在卵黄原蛋白基因 (Bombyx mori vitellogenin, BmVg) 高量表达前的雌雄血淋巴中20E含量没有明显差异,但含量变化趋势与BmVg表达趋势相一致. 用20E注射上蔟后60 h的家蚕和添食5龄家蚕, 能诱导雌性和雄性脂肪体中BmVg表达和蛋白合成. 调查处理后的家蚕所产卵中的卵黄磷蛋白（BmVn）含量及重量,发现蚕卵中BmVn含量及蚕卵重量都明显增加|本研究还通过脂肪体体外培养,证明了20E是直接作用于脂肪体来诱导BmVg的表达. 本研究结果表明,20E是通过诱导脂肪体中BmVg的转录来增加蚕卵中BmVn积累,从而最终使得蚕卵重量也相应增加.     

保幼激素和蜕皮激素调控昆虫变态发育机制的进展

变态发育是昆虫适应生态环境和气候变化的主要生存策略之一.保幼激素(juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的相互作用主要调控昆虫组织凋亡和重建、蜕皮等变态生理活动,近年来保幼激素和蜕皮激素调控昆虫变态发育的分子机制取得了较大的进展.本研究总结了JH和20E的合成...     

棉铃虫卵内蛋白酶性质研究

在棉铃虫Helicoverpa armigera卵母细胞内检测到蛋白酶活性,其作用Ph在酸性范围,酶活性受E-64、Pepstatin和iPr₂P-F等多种抑制剂抑制。在Ph4.0时蛋白酶对牛血红蛋白有较高水解率。抗蓖麻蚕Philosamia cynthia ricini卵半胱氨酸蛋白酶血清和抗蓖麻蚕卵天冬氨酸蛋白酶血清可以识别棉铃虫卵内成分。实验结果表明;棉铃虫卵内可能存在半胱氨酸蛋白酶类、丝氨酸蛋白酶类和天冬氨酸蛋白酶类,并且与蓖麻蚕卵内蛋白酶有一定的相似性。     

棉铃虫酪氨酸羟化酶基因的分子特性及功能分析

【目的】酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是黑色素形成的关键酶,在昆虫表皮骨化过程中扮演重要角色。本研究旨在获得棉铃虫Helicoverpa armigera TH基因序列,并研究其分子特性、表达模式和功能,为更深入探析该基因作用机理奠定基础。【方法】通过生物信息学和分子生物学技术获得了棉铃虫TH基因序列,利用qRT-PCR分析该基因在棉铃虫不同生长发育阶段的表达模式;利用qRT-PCR技术,分别测定了蜕皮激素20E(400 ng/头)处理不同时间和RNAi成功干扰蜕皮激素受体基因(EcR)前提下再用20E(400 ng/头)处理后,棉铃虫5龄幼虫TH表达量变化;采用生物化学方法检测鞣化激素(30 μg/mg组织)和环腺苷酸(cAMP, 200 ng/mg 组织)处理后棉铃虫幼虫脂肪体中TH活性。【结果】获得了棉铃虫酪氨酸羟化酶基因TH (GenBank登录号: MF440319) cDNA片段,长2 270 bp,开放阅读框1 686 bp,编码561个氨基酸残基。该基因在棉铃虫整个发育期均表达,其中在卵期第3天、2龄幼虫第1天、3-5龄蜕皮期、预蛹期和成虫羽化第1天表达量相对较高。研究还发现,400 ng/头 20E注射能够促进TH的转录;在成功干扰并调低幼虫EcR转录水平的前提条件下(对照仅注射dsGFP)再注射20E,对TH表达量无明显影响;而鞣化激素(30 μg/mg组织)和cAMP(200 ng/mg组织)均显著提高了TH的酶活性。【结论】20E在转录水平参与了TH的表达;鞣化激素和cAMP均能够提高TH活性,在蛋白水平上对TH进行调控。     

从大豆中纯化棉铃虫组织蛋白酶B抑制因子HCB-SoyI

棉铃虫组织蛋白酶B（Helicoverpa armigera cathepsin B,HCB） 在胚胎发育过程中降解卵黄蛋白为氨基酸,供给胚胎发育必需的养料,是棉铃虫胚胎正常发育的重要因素。许多植物种子中存在蛋白酶抑制因子,如大豆和向日葵种子。用棉铃虫组织蛋白酶B为酶源,通过硫酸铵沉淀、排阻层析和离子交换层析等方法,从大豆中分离纯化到了一种对HCB有抑制活性的蛋白酶抑制因子,命名为HCB-SoyI。用牛血清白蛋白为底物进一步证明该抑制因子对HCB具有抑制作用。该抑制因子的纯化为进一步克隆其基因奠定了基础,为转基因抗虫作物研究提供了新的候选靶标。     

果蝇蜕皮激素诱导程序性细胞死亡的遗传调控因子

近年来关于果蝇程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）的研究结果表明,在果蝇的变态发育过程中,蜕皮激素与受体结合后诱导转录因子的表达。这些转录因子作为程序性细胞死亡调控网络中的初、次级应答信号,激活凋亡诱导因子Reaper、Hid和Grim的表达。Reaper、Hid和Grim进而阻止凋亡蛋白抑制因子的活性,从而启动半胱氨酸蛋白酶caspase途径,引起细胞凋亡（apoptosis）。该文综述了蜕皮激素诱导的果蝇程序性细胞死亡中各遗传调控因子之间的关系。     

棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的鉴定

根据棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)中肠酶液对蛋白酶专性底物在不同pH下的水解作用,棉铃虫中肠的3种丝氨酸蛋白酶得到鉴定。它们是：强碱性类胰蛋白酶,水 解a-N-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺的最适pH在10.50以上;弱碱性类胰蛋白酶,水解p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯的最适pH为8.50～9.00;类胰凝乳蛋白酶, 水解N一苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的最适pH亦为8.50-9.00。中肠总蛋白酶活性用偶 氮酪蛋白测定,最适pH亦在10.50以上。Ca²⁺对昆虫蛋白酶无影响,Mg²⁺仅对弱碱性类胰蛋白酶有激活作用。对苯甲基磺酰氟和甲基磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮对弱碱性类胰蛋白酶的抑制作用较强,而对强碱性类胰蛋白酶的抑制作用较弱。甲基磺酰-L苯丙氨酸氯甲基酮除能抑制类胰凝乳蛋白酶外,还能激活弱碱性类胰蛋白酶。对牛胰蛋白酶有强抑制作用的卵粘蛋白抑制剂对昆虫蛋白酶却无抑制作用。大豆胰蛋白酶抑制剂对该虫的3种丝氨酸蛋白酶均有强的抑制作用。     

棉铃虫4龄幼虫的摄食行为和中肠蛋白酶活性的变化

通过测定棉铃虫4龄幼虫,每隔12 h的摄食量、体重净增量以及丝氨酸蛋白酶活性的变化,揭示了它的取食行为及中肠蛋白酶活性的变化规律。结果表明:棉铃虫4龄幼虫取食及消化呈有规律的变化,蜕皮后4龄初,摄食量、体重净增量、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活性均逐渐增加;进入中期(36～48 h),各项指标达到最高值;其后,随着摄食量的下降,各项指标逐渐下降。同时, 连续观察幼虫取食高峰期的取食行为6 h,结果表明: 其间一次连续取食的平均时间为(3.6±0.4) min/次, 总平均取食时间为(62.4±8.9) min,约占整个时间的1/6。该文还对棉铃虫4龄幼虫不同时段取食行为与蛋白酶活性变化之间的相关性及调控机制作了初步讨论。     

棉铃虫幼虫感染棉铃虫微孢子虫后的组织病理变化

1997年田间调查时发现一种寄生于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）的微孢子虫Nosema sp.,它对棉铃虫有较强的致病力并可经卵垂直传播。利用透射电镜对棉铃虫幼虫感染该微孢子虫后的组织病理变化进行了初步观察。结果表明：该微孢子虫可侵染棉铃虫的中肠、马氏管、脂肪体、神经等组织;侵染后可导致寄主中肠的微绒毛脱落,线粒体内脊排列方向发生变化,线粒体整体发生变形并最终瓦解;内质网发生断裂;细胞核体积变小并变形,但该微孢子虫并不入侵细胞核;马氏管膨大,边缘向外突出隆起;神经细胞的细胞核变成长条形,细胞界线模糊;在神经细胞内也发现了微孢子虫孢子,证明该微孢子虫也入侵寄主神经细胞。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生理和生长发育的影响

本研究根据棉铃虫Helicotverpa ormigera(Hubner)幼虫中肠蛋白酶在离体条件下对蛋白酶抑制剂的反应,选择具有较强抑制作用的大豆胰蛋白酶抑制剂,以0.21-4.2%(干重)的浓度配入幼虫人工饲料,测定了幼虫短期和长期取食这些饲料引起的中肠类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力的变化和生长抑制效应。短期取食抑制剂的幼虫,中肠弱碱性类胰蛋白酶活力显著增高,在4.2%。浓度下比对照高出21%;强碱性类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,生长发育受到明显抑制。长期取食低浓度(0.84%)抑制剂的幼虫,弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力显著增高,强碱性类胰蛋白酶活力显著降低。总蛋白酶活力变化不显著;长期取食高浓度(4.2%)抑制剂的幼虫,强碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,其它酶活力变化不显著。抑制剂随浓度的增高对幼虫生长的抑制作用加强,但浓度高于0.84%后,抑制强度的变化减小。据此作者认为,蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用,从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏,昆虫消化过程受阻,影响生长发育。     

棉铃虫漆酶2基因的分子鉴定

【目的】黑化反应在昆虫表皮骨化以及免疫防御过程中起着重要作用, 酚氧化酶是黑化反应中的关键酶类, 漆酶2 (laccase2, LAC2)是酚氧化酶的一种, 在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要的作用。本研究旨在探讨LAC2在棉铃虫Helicoverpa armigera表皮骨化中表达模式及激素调控作用。 【方法】采用PCR及RACE的方法, 从棉铃虫5龄幼虫中得到了lac2 cDNA全序列。利用荧光定量PCR、 激素处理及RNA干扰方法, 对LAC2的表达模式差异和激素调控作用进行分析。【结果】序列分析表明, lac2 cDNA全长3 221 bp, 编码框长度为2 268 bp, 编码756个氨基酸残基。发育时序表达分析发现, lac2在幼虫各龄期表达规律相似, 均在蜕皮期高水平表达, 在5龄96 h转录水平达到最高峰。组织表达结果分析, lac2基因在幼虫表皮和成虫卵巢以及触角表达量较高。激素处理实验发现, 保幼激素类似物（methoprene）对lac2基因转录有抑制作用; 蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）则促进其表达。进一步利用RNA干扰蜕皮激素受体EcR （ecdysone receptor）和USP （ultraspiracle isoform）基因发现, 干扰后蜕皮激素受体的表达明显受到抑制, 同时lac2基因的表达也显著受到抑制, 表明蜕皮激素调控lac2基因转录。【结论】这些结果为进一步研究漆酶在昆虫表皮的骨化以及免疫防御等方面不同的生理功能提供理论依据。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒组织蛋白酶基因的序列分析和进化研究

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（HaSNPV)的组织蛋白酶（v-cath）基因进行了序列分析,此基因编码区长1098bp,预防编码一个366个氨基酸的蛋白产物,序列分析表明,HaSNPV的V－CATH蛋白与共它杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构并保留有相同的酶活性位点,根据已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建了v-cath基因的进化树,发现HaSNPV的v-cath位于NPV组中一个单独的分枝,结合v-cath基因在棉铃虫病毒基因组中的位置与其它NPV有较大不同,推测HaSNPV的v-cath基因可能拥有特殊的进化历程。     

蜕皮激素与其受体EcR-USP的转录调控机制

蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)是一种典型的类固醇激素, 主导调控昆虫的蜕皮、变态、生殖等重要生理过程。20E受体EcR-USP已被鉴定近20年, 20E与其受体复合物的转录调控机制也有了许多重要突破。已有研究表明： （1）20E受体由核受体EcR和USP形成; （2）EcR-USP异源二聚体在分子伴侣蛋白复合物的协助下获得DNA结合活性; （3）20E通过解除共阻遏因子和募集共激活因子来激活EcR USP异源二聚体并启动下游基因的转录; (4）20E-EcR-USP配体-受体复合物引发20E初级应答基因的表达, 由20E初级反应基因编码的转录因子诱导表达的20E次级应答基因级联放大20E信号, 从而调控昆虫蜕皮、变态、生殖等生理过程。