肌球蛋白轻链激酶非激酶活性调节磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为进一步阐明MLCK非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用,利用已删除部分激酶区域的MLCK重组体(pGEXF6.5)在大肠杆菌中进行表达,采用亲和层析技术纯化表达的MLCK片段,应用EnzChek磷分析试剂盒检测MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、水解重酶解肌球蛋白(heavymeromyosin,HMM)及肌球蛋白亚片段1(subfragmentl,S1)ATP酶活性的影响,体外检测MLCK片段对肌动蛋白肌丝运动的调节.研究结果显示,pGEX-F6.5重组表达载体在大肠杆菌中以可溶性GST融合蛋白的形式表达.该融合蛋白经Glutathione-Sepharose4B纯化、SDS-PAGE鉴定得到较纯的单一表达条带.纯化的MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、HMM和S1的ATP酶活性均有明显激活作用.MLCK片段激活磷酸化肌球蛋白ATP酶活性为:Vmax=(19.426±1.669)倍;Km=(0.486±0.106)μmol/L,MLCK片段对磷酸化HMM和S1的ATP酶活性也有相似的刺激作用.体外肌丝运动研究表明,随着MLCK片段浓度的增加,磷酸化肌球蛋白与肌动蛋白结合的数量不断增加,肌丝运动的速度也随之增加.上述结果表明,MLCK的C端非激酶活性具有调节磷酸化的肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动的作用.     

钙调蛋白结合蛋白,类肌钙蛋白和脊椎动物平滑肌收缩的调节

平滑肌细胞包含有粗肌丝、细肌丝和中等纤维。一般认为Ｃａ＾２＋／ＣａＭ依赖性的肌球蛋白磷酸化作用是平滑肌收缩的重要调控环节。然而,新近在平滑肌中发现钙调蛋白结合蛋白和类肌钙蛋白,它们也参与平滑肌收缩的调节。     

平滑肌肌球蛋白磷酸化与肌动球蛋白功能调节

在有Ｃａ２＋和钙调蛋白存在时,肌球蛋白轻链激酶催化肌球蛋白磷酸化,促使肌动蛋白激活的肌球蛋白（肌动球蛋白）Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性显著增加．然而,肌球蛋白磷酸化水平与Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶之间的关系是非线性的,原肌球蛋白可以进一步增加Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶的活性,但仍不改变它们之间的非线性关系．肌球蛋白轻链激酶的合成肽抑制剂抑制了肌球蛋白磷酸化和Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性,并导致平滑肌去膜肌纤维的等长收缩张力与速度的降低．结果提示肌球蛋白轻链激酶参与脊椎动物平滑肌收缩的调节过程,肌球蛋白轻链磷酸化作用会引起平滑肌收缩     

一种新的平滑肌调控蛋白Calponin

Calponin为一种平滑肌特有的调控蛋白, 分子克隆的证据表明, 它具有两种亚型, α型和β型分别由292和252个氨基酸组成它能与肌动蛋白结合, 抑制肌球蛋白ATP酶活性和平滑肌收缩其与肌动蛋白结合域有38个氨基酸残基(第145～182位), 丝氨酸175在调宁蛋白与肌动蛋白的相互作用中起重要作用, 它还能与钙调蛋白结合, 呈钙依赖性, 其结构域在第52～144位残基调宁蛋白的机能受磷酸化与脱磷酸化的调节.     

平滑肌收缩调节的信号转导

平滑肌细胞内信号转导主要有肌球蛋白轻链激酶（ＭＬＣＫ）和蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）途径。前者通过肌浆内Ｃａ＾２＋浓度升高,激活钙调蛋白（ＣａＭ）依赖性ＭＬＣＫ,催化肌球蛋白轻链丝氨酸（Ｓｅｒ）－１９磷酸化,肌球蛋白ＡＴＰ酶活性增加,肌丝滑行,肌肉收缩。肌浆内Ｃａ＾２＋浓度的恢复使ＭＬＣＫ失活,肌球蛋白轻链磷酸酶（ＭＬＣＰ）使肌球蛋白脱磷酸化,肌肉舒张。近来有证据表明ＰＫＣ信号转导途径通过影响细肌丝相关蛋     

RhoA/ROCK信号通路对血管平滑肌收缩的调节作用及研究进展

血管平滑肌的异常收缩是引起许多疾病的重要因素,如高血压,脑血管痉挛等,对于平滑肌收缩调节机制的研究为治疗这些疾病带来新的思路和方向.研究表明小GTP结合蛋白RhoA及其下游信号分子ROCK在平滑肌收缩调节,尤其是钙敏化调节机制中起到关键作用.RhoA/ROCK通路通过抑制MLCP活性而增强MLC的磷酸化水平,从而调节平滑肌收缩,此外,它还参与调节其它细胞的多种细胞功能,如应力纤维的生成,细胞分裂及迁移等.本综述主要介绍RhoA/ROCK通路在血管平滑肌收缩功能的调节机制及研究进展.     

小檗碱对平滑肌肌球蛋白功能及胃肠平滑肌收缩性的影响

目的:探讨小檗碱对平滑肌肌球蛋白功能及胃肠平滑肌收缩性的影响.方法:以平滑肌肌球蛋白Mg2+-ATPase活性、肌球蛋白磷酸化以及胃与肠道平滑肌的收缩振幅为指标,考察小檗碱对平滑肌肌球蛋白Mg2+-ATPase活性和肌球蛋白磷酸化程度的影响,及其对离体小肠与胃平滑肌条收缩性的影响.结果:(1)在肌球蛋白轻链的Ca2+依赖性磷酸化反应中.小檗碱能抑制磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATPase活性;(2)在肌球蛋白轻链的Ca2+依赖性磷酸化反应中,小檗碱可显著抑制磷酸化肌球蛋白轻链磷酸化程度;(3)小檗碱对大鼠离体小肠及胃平滑肌条收缩性均具有抑制作用.且均呈剂量依赖性.结论:小檗碱可通过抑制平滑肌肌球蛋白的功能,抑制胃肠道平滑肌的收缩性.     

甲壳动物横纹肌的收缩蛋白质与调节机制

甲壳动物横纹肌肌原纤维的肌丝陈列,收缩蛋白质和收缩的Ca²⁺依赖性调节机制与脊椎动物横纹肌有不少差异.脊椎动物横纹肌、甲壳动物快肌与慢肌的粗丝与细丝的数量比依次为1:2,1:3和1:6,肌丝阵列各异.甲壳动物粗肌丝由肌球蛋白和副肌球蛋白组成,其分子装配与脊椎动物不同.细肌丝含有肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白,肌钙蛋白-T分子量较高,肌钙蛋白-C仅1个Ca²⁺结合位点.甲壳动物横纹肌兼有细肌丝调节与粗肌丝调节.     

RhoA-ROK通路在平滑肌收缩中的作用

近年来有关平滑肌收缩的钙敏化机制研究进展迅速,一系列的证据显示这种Ca2 非依赖的调节主要是由RhoA-ROK通路介导,它主要通过磷酸化抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的活性来增加肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平,从而增强平滑肌的收缩力。越来越多的研究显示RhoA-ROK通路参与了平滑肌细胞和非肌细胞的多种功能,在许多疾病如高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉痉挛等的发生和发展中起着非常重要的作用。     

平滑肌细胞迁移的肌球蛋白轻链非磷酸化途径

为了阐明平滑肌细胞迁移存在肌球蛋白轻链非磷酸化调节途径,研究花生四烯酸(arachidonicacid,AA)对肌球蛋白轻链非磷酸化状态下平滑肌细胞迁移的影响及其相关的信号传导途径.经Boyden小室跨膜迁移实验发现,AA对培养的兔血管平滑肌SM3细胞具有明显的诱导迁移作用.然而,当预先用10μmolL肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase,MLCK)特异性抑制剂ML7作用SM3细胞后,发现AA对SM3细胞仍然具有明显的诱导迁移作用,并呈剂量依赖性,这种诱导作用可被细胞外信号调节激酶12(ERK12)的特异性抑制剂PD98059或磷脂酶C(PLC)的特异性抑制剂U73122所拮抗.此外,Ⅱ型肌球蛋白抑制剂blebbistatin(BLB)可部分抑制“非磷酸化”状态下AA的诱导迁移作用.经Western印迹检测显示,10μmolLML7可完全抑制SM3细胞中20kD肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化,并且加入AA后MLC20仍为非磷酸化状态.应用免疫荧光染色法观察肌动蛋白在SM3细胞中分布的变化,发现在AA作用下肌动蛋白呈细胞边缘聚集现象,有伪足形成,细胞形态表现为迁移状态.预先用ML7作用后再加入AA,肌动蛋白的分布与上述结果相同.研究结果初步表明,在平滑肌细胞迁移的作用途径中,在MLC磷酸化调节途径受到抑制时,AA可诱导MLC非磷酸化的平滑肌细胞发生迁移,其分子机理可能与ERK12和PLC信号传导途径有关,非磷酸化的肌球蛋白直接参与了该迁移过程.     

LIMK1/Cofilin信号通路与肿瘤的研究进展

LIMK1是一种存在于真核生物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,Cofilin是存在于真核生物中的一种低相对分子质量的肌动蛋白结合蛋白。LIMK1磷酸化并使Cofilin失活,磷酸化Cofilin的肌动蛋白结合活性降低,从而导致肌动蛋白聚合并使其稳定。LIMK1/Cofilin信号通路调节细胞骨架蛋白,并且参与微丝肌动蛋白应力纤维和黏附斑形成,进而调节微丝骨架系统影响肿瘤细胞的转移。根据目前国内外的各项研究成果,就LIMK1/Cofilin信号通路与肿瘤的研究进展予以综述。     

碱性调宁蛋白的研究进展

碱性调宁蛋白是一个首先从鸡砂囊和牛主动脉中分离出的相对分子质量为34×103的碱性蛋白。它在平滑肌中特异表达,结合钙调蛋白,肌动蛋白,肌球蛋白,抑制肌球蛋白的ATP酶活性,参与平滑肌收缩、细胞信号转导、维持细胞骨架、抑制细胞增生等。     

钙离子:进入细胞浆的途径与血管平滑肌收缩机制

血管平滑肌收缩所需的钙离子源于细胞外流入和细胞内释放。钙流入途径主要有膜电位依赖式和与受体耦联的钙通道。释放钙离子机制受除极IP_3、cIP_3和钙离子作用而激发。进入细胞浆的钙离子与钙受体蛋白结合而引起收缩。血管平滑肌没有肌钙蛋白C,由钙调蛋白或Leiotonin C代之。钙调蛋白通过使肌球蛋白磷酸化;而Leiotonin C则通过直接激活肌动蛋白,引起血管收缩。     

ERM蛋白在微血管内皮细胞通透性调控中的研究进展

埃兹蛋白(Ezrin)/根蛋白(Radixin)/膜突蛋白(Moesin)(ERM)是细胞膜与胞内骨架的连接蛋白,具有高度同源性。细胞外刺激因子可通过多种信号通路磷酸化ERM蛋白,使细胞骨架重构,从而调控微血管内皮细胞通透性,在感染、炎症、代谢异常等病理过程中发挥作用。ERM功能调节的一个重要环节就是其羧基末端苏氨酸残基磷酸化后引起ERM构象的改变,暴露的羧基末端尾部的肌动蛋白(actin)-细胞骨架结合位点;故通过ERM的桥接作用,可将肌动蛋白微丝与细胞膜相连,使血管内皮细胞屏障功能发生变化。目前已知能使ERM磷酸化的激酶有蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Rho相关激酶(ROCK),分别通过p38-MAPK、Rho/ROCK、PKC信号通路参与微血管内皮屏障功能的调控。本文旨在阐述ERM及其相关信号通路在微血管内皮细胞通透性调控中发挥的作用。     

蛋白质可逆磷酸化对花粉管生长的调控作用

花粉管极性生长受多种信号与代谢过程的调控,主要包括Rop GTPase信号途径、磷脂酰肌醇信号通路、Ca²⁺信号途径、肌动蛋白动态变化、囊泡运输、细胞壁重塑等,这些过程都受到蛋白质可逆磷酸化作用的调节。如：(1) Rop调节蛋白(GEF、GDI和GAP)的可逆磷酸化可以改变其活性,从而调节Rop GTPase;同时,蛋白激酶还可能作为Rop下游的效应器分子参与Rop下游信号途径的调节;(2) 蛋白质可逆磷酸化作用既能够激活/失活质膜上的Ca²⁺通道或Ca²⁺泵,又参与调节胞内贮存Ca²⁺的释放,从而调控花粉管尖端Ca²⁺梯度的形成;此外,蛋白激酶还作为Ca²⁺信号的感受器,磷酸化相应的靶蛋白,参与Ca²⁺信号下游途径的调节;(3) 肌动蛋白结合蛋白(ADF和Profilin)的活性也受到蛋白质可逆磷酸化的调节,进而调控肌动蛋白聚合与解聚之间的动态平衡;(4) 蛋白质磷酸化作用调节胞吞/胞吐相关蛋白的活性,并调控质膜的磷脂代谢,从而参与调控囊泡运输过程;(5) 胞质丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和蔗糖合酶的可逆磷酸化可以调节其在花粉管中的功能与分布模式,参与花粉管细胞壁重塑;(6) 转录调节蛋白与真核生物翻译起始因子的可逆磷酸化可以改变其活性,从而调控RNA转录与蛋白质合成。文章主要综述了花粉管生长过程中重要蛋白质的可逆磷酸化作用对上述关键事件的调节。     

类肌钙蛋白（Calponin）亚型和生物学功能

Calponin(类肌钙蛋白)是一个肌动蛋白细肌丝相关的调节蛋白,表达在平滑肌细胞和许多类型的非肌细胞中。哺乳动物有Calponin 1、Calponin 2和Calponin 3三个亚型,分别由三个同源基因CNN1、CNN2和CNN3编码,表达于不同的细胞类型,并执行细胞类型特异性的生理功能。除了调节平滑肌收缩功能,Calponin还调节非肌细胞肌动蛋白骨架的功能并参与多种细胞生命活动,如增殖、粘附、迁移、分化、吞噬和细胞融合等。本综述重点讨论Calponin亚型的基因进化、组织和细胞类型特异性表达、结构和功能的关系以及相关的调节机制。     

蜜蜂飞翔肌收缩蛋白的电子显微镜鉴定

自五十年代肌丝滑行模型建立以来,关于脊椎动物骨胳肌的蛋白质成分,肌丝排列以及肌肉收缩时结构变化的研究取得了很大的进展。骨胳肌肌原纤维由粗、细肌丝有规律地排列所组成。对于肌肉收缩蛋白的选择性抽提,专一性抗体标记以及重组肌丝的研究,证实肌球蛋白存在于粗肌丝;肌动蛋白、原肌球蛋白和原宁蛋白存在于细肌丝(Huxley,A.F.,1957;Huxley,H.E;,1972)。昆虫间接飞翔肌的结构和生理特性有许多不同于脊椎动物骨胳肌的特点。蜜蜂飞翔肌肌原纤维虽然也包含有粗、细两     

血小板收缩蛋白功能的调节——肌球蛋白轻链磷酸化学说

血小板收缩蛋白功能调节是通过Ca~(2+)依赖的钙调素(calmodulin,CM)激活肌球蛋白轻链激酶而使肌球蛋白20000道尔顿轻链磷酸化实现的。细胞内Ca~(2+)浓度的高低决定了Ca~(2+)-CM复合物是否形成,因此,Ca~(2+)在调节中起着关键作用。cAMP阻抑CM与肌球蛋白激酶结合,从而抑制肌球蛋白轻链磷酸化,对收缩蛋白活动起抑制作用。     

钙调蛋白结合蛋白通过调节细胞骨架稳定性影响肿瘤细胞运动能力

轻链钙调蛋白结合蛋白（light-chain Caldesmon,l-CaD）是一种重要的肌动蛋白结合蛋白,普遍存在于众多非肌肉细胞中。体外研究证明,l-CaD能通过与肌动蛋白的结合起到促进原肌动蛋白（G-actin）聚合、稳定肌动蛋白纤维（F-actin）结构的作用。在磷酸化作用下,l-CaD能从肌动蛋白纤维上脱离并促进肌动蛋白纤维的解聚。该研究拟考察l-CaD在细胞内对细胞肌动蛋白骨架的调节作用,阐明l-CaD对细胞运动能力的影响,作者将天然低表达l-CaD的人源性乳腺癌细胞MCF-7作为细胞模型,在MCF-7胞内以基因转染的方式高表达外源野生型l-CaD及其磷酸化突变株A1234-CaD（不可磷酸化CaD）、D1234-CaD（完全磷酸化CaD）。首先,通过激光共聚焦扫描,探讨了l-CaD对细胞骨架重排的调节;其次,通过细胞迁移transwell阵列,检测了l-CaD对细胞迁移能力的影响;最后,在单细胞层次上测定了细胞基底牵张力、胰酶刺激下的细胞基底脱附能力,并进一步检测了l-CaD对细胞迁移子过程中细胞伸张、收缩的影响。研究结果显示,l-CaD在胞内对细胞骨架的形成有显著的调控作用。非磷酸化l-CaD主要富集在细胞骨架上,增强了细胞骨架的强度,导致细胞基底牵张力以及对胰酶的耐受性增强,但对细胞的迁移能力有显著的抑制作用;磷酸化l-CaD跟细胞骨架结合能力很弱,对细胞的运动能力没有显著影响。通过磷酸化,l-CaD起到了一个“蛋白开关”的作用,通过控制细胞骨架的解聚、重排来调节细胞的运动能力。     

李斯特菌诱导宿主细胞骨架重排与磷脂酶D

无论是免疫细胞对病原体的主动吞噬,还是病原体诱导非吞噬细胞的被动吞噬,均是不同细胞膜受体介导的细胞肌动蛋白骨架重排过程,受到单体G蛋白和肌动蛋白骨架相关蛋白的精密调控。细胞内重要信号蛋白,磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D(PLD)的活性变化与细胞肌动蛋白骨架重排密切相关,其参与调节了由抗体受体(FcγR)及补体受体(CR3)介导的免疫细胞的主动吞噬,而细胞肌动蛋白骨架解聚蛋白cofilin被磷酸化后可与PLD结合并激活PLD,进而调节肌动蛋白骨架重排。另一方面,cofilin磷酸化状态严格调控李斯特菌感染细胞过程中的肌动蛋白骨架重排。因此,阐明PLD是否在李斯特菌感染细胞过程中被激活并参与调节肌动蛋白骨架重排,将有助于揭示PLD激活对感染发生的调控作用,对透彻理解细菌感染宿主细胞的分子机制具有重要意义。