自动化神经组织单细胞悬液制备探索性实验教学实践

组织单细胞悬液制备是细胞生物学中的基础技能,常用的组织解离方法有机械法和酶法,不同解离方法在细胞得率和细胞活性上差异较大。在神经科学的各个研究领域,包括发育研究、疾病病理生理学、药物和毒素筛选,以及神经疾病动物模型的移植等均需要使用分离的单细胞。然而神经组织细胞间紧密的黏附性及轴突和树突的易碎性阻碍单细胞的获得。自动化组织处理器结合机械法与酶法双重作用可获得高质量的细胞悬液。利用这一技术开展自主设计型神经组织单细胞悬液制备实验,以提升学生综合分析应用能力,拓展对前沿科学技术的认识。通过科研与教学相融合的方式,更好地激发医学生的学习热情,提高医学生的科研素质,实现研究型与创新型人才培养的目标。     

流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法

相对于动物和微生物而言,流式细胞术在植物科学上的应用会因植物组织与细胞(如细胞壁、中央液泡、特殊细胞器等)的特殊结构以及次生代谢产物等特殊成分,造成样品在前期处理、染色及测试等方面的困难,甚至导致检测失败或结果不准确。笔者在长期运用流式细胞仪测试工作中,积累了大量的植物样本检测经验,并参考国内外相关文献,总结出从植物取材、样品制备到植物细胞核DNA流式检测的方法和技巧,可为植物科学研究者及从事流式细胞检测的技术人员提供实验参考。     

小鼠肝血窦内皮细胞分离与鉴定新方法

目的:改进小鼠原代肝血窦内皮细胞的分离方法。方法:经过小鼠肝脏的原位灌洗、消化制备单细胞悬液、差速离心、密度梯度离心以及免疫磁珠分选等步骤,分离获得小鼠原代肝血窦内皮细胞,再通过流式细胞仪鉴定、细胞内吞功能染色以及对细胞超微结构的电子显微镜观察,对分离出的肝血窦内皮细胞进行鉴定。结果:肝血窦内皮细胞的平均得率为5.6×10~6个/只小鼠,细胞活性比率约为96%左右;细胞流式鉴定结果显示新鲜分离出的肝血窦内皮细胞VEGFR3阳性率达到95.8%,VEGFR2+CD31+双阳性细胞阳性率达到93.7%。分选出的LSECs能够有效吞噬FITC-FSA和Dil-Ac-LDL。培养1天后肝血窦内皮细胞的微观结构,可见其特征性的窗孔和筛板。结论:本文总结的分离方法可以稳定、高效地获得小鼠原代肝血窦内皮细胞。     

高活性小鼠大脑单细胞制备及流式细胞分选

小鼠脑组织内含有各种神经细胞,而大脑组织却十分脆弱。如何解离小鼠大脑组织并成功进行流式细胞分选以获得高活性、高纯度的细胞样本,对后续研究大脑相关疾病的发病机制具有重要意义。该文从样本前处理到流式细胞分选全流程作了详细的阐述,为后续单细胞测序和其他相关实验提供技术参考。     

应用双光子显微镜和流式细胞仪定性及定量确定小鼠巨噬细胞的吞噬功能

建立了流式细胞仪和双光子激光共聚焦荧光显微镜进行定性和定量检测小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法,并同传统光学显微镜细胞化学染色观察方法相比较,探讨其检测巨噬细胞吞噬效应的优越性。常规方法获取小鼠腹腔和脾脏巨噬细胞,制备巨噬细胞悬液。常规制备鸡红细胞,计数并调整活细胞数,用5-二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯(5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)染色,与巨噬细胞共温育一定时间后,小鼠巨噬细胞特异性荧光抗体F4/80标记巨噬细胞。应用流式细胞仪检测巨噬细胞中CFSE阳性百分率来表示巨噬细胞吞噬率;应用双光子显微镜观察被吞噬的CFSE阳性鸡红细胞动态分布情况。同时,采用传统光学显微镜吉姆萨染色观察巨噬细胞吞噬百分率。结果显示,流式细胞仪结合双光子显微镜检测巨噬细胞吞噬率与传统的显微镜计数法比较,两者有明显的正相关性。双光子显微镜和流式细胞仪可以定性与定量检测巨噬细胞吞噬功能,该方法具有灵敏、快捷、重复性好以及准确率高的特点,是进行免疫学研究的可行方法。     

基于液氮研磨法的流式细胞术检测马铃薯倍性的研究

染色体组倍性鉴定是马铃薯种质资源评价的重要内容,流式细胞仪能够快速、准确地对细胞核DNA含量进行测定,从而广泛用于检测植物染色体组倍性。建立适于马铃薯倍性鉴定的高通量流式细胞术体系,对马铃薯育种工作提供依据。以20份马铃薯合作88孤雌诱导后代为材料,用液氮研磨法制备叶片细胞核悬液,并将其与传统刀片切碎法制备的细胞核悬液进行比较,对已知四倍体马铃薯合作88和二倍体马铃薯IVP101进行染色体倍性测定,结果发现这两种方法在倍性测定结果之间无明显差异,但是液氮研磨法操作简单、耗时少。基于液氮研磨法的流式细胞术可快速、准确检测其倍性。另外,在液氮研磨法中,对细胞核悬液染色时间的长短(从15 min到12 h)并不会影响倍性测定结果,从而方便研究人员在实际操作中灵活选择染色时间。     

一种手动解离、免疫磁珠分选加TIC培养液改良的小鼠原代海马小胶质细胞培养法

本文旨在研究手动解离、免疫磁珠分选加TIC培养液改良原代小胶质细胞的培养方法,获得高活性、高纯度且与在体状态更接近的小鼠海马原代小胶质细胞,以用于小胶质细胞的相关研究。选取2～4周龄SPF级C57BL/6J小鼠,PBS灌注后取海马组织剪碎,使用成年鼠脑组织解离试剂盒手动解离海马组织,获得单细胞悬液,再经去碎片试剂去除髓鞘等组织碎片。在4°C孵育CD11b免疫磁珠15 min后,细胞悬液经免疫磁珠细胞分选(magnetic activated cell sorting, MACS)两次过柱提高小胶质细胞纯度。将分选后细胞离心重悬,种在多聚赖氨酸包被后的24孔培养板中,用完全培养基或TIC培养液(以TGF-β、IL-34和胆固醇为主要营养成分的无血清培养基)培养4 d后进行其他检测。结果显示:(1)使用成年鼠脑组织解离试剂盒手动解离可得到含有(56.03±2.10)%活细胞的单细胞悬液;(2)与免疫抗体包被筛选法(immunopanning)相比,经过MACS两步分选后,可得到更多且纯度高达(86.20±0.68)%的小胶质细胞;(3)使用TIC培养液培养4 d后,可获得分枝状、形态类似静息状态的原代小胶质细胞;(4) q RT-PCR检测显示,与完全培养基培养相比,TIC培养液培养的小胶质细胞在4 d和7 d后TNF-α、IL-1β及CCL2 m RNA表达水平更接近急性分离后的小胶质细胞。上述结果提示,采用手动解离海马组织,经MACS两步分选及TIC培养后,可以获得高纯度、高活性且接近在体静息状态的小胶质细胞。     

不同组织器官粗提物对小鼠照射后肠腺存活率的影响

我们以前的实验证实,用刮取法刮取正常小鼠的肠腺部分,将其制备成单细胞悬液,注入到经30Gy y线全身照射小鼠的一段空肠内,72h后用光镜和电镜观察到有肠腺再生。以后分别用冻融和超声。及加热处理肠腺细胞悬液,也可得到同样结果。因此证明,在小鼠肠腺细胞悬液中,存在促进肠     

杨柳科植物倍性测定不同解离缓冲液效果比对分析

多倍体育种是杨柳科植物育种的重要手段,利用流式细胞仪可以对植物的倍性进行检测,然而解离缓冲液选择是否合适对检测结果有重要影响。本研究利用不同缓冲液对杨柳科植物叶片进行了解离,然后用流式细胞仪测定了解离细胞核的前向散射光(FS)、侧向散射光(SS)、相对荧光强度(FL)、G_0/G_1期峰的变异系数(CV)以及背景碎片系数(DF)等参数。结果比对分析表明,SLB-3缓冲液解离出的细胞核DNA平均荧光强度高、变异系数小,同时对所有被测物种均有较理想的解离效果,是利用流式细胞仪测定杨柳科植物倍性的理想解离缓冲液。SLB-3解离缓冲液的配方为:0.5 mmol·L~(-1)四盐酸精胺,30 mmol·L~(-1)柠檬酸钠,200 mmol·L~(-1)Tris,80 mmol·L~(-1)KCl,0.5%(v/v)Triton X~(-1)00,p H7.5。通过研究,我们建立了利用FCM测定杨柳科植物倍性的实验体系,为杨柳科植物多倍体育种提供了可靠的实验技术手段。     

急性呼吸窘迫综合征小鼠肺内源性干细胞表达水平的研究

目的探讨急性呼吸窘迫综合征（ARDS）小鼠肺组织中肺内源性干细胞的表达水平。 方法10只C57BL/6小鼠分成两组：实验组和对照组,实验组通过气管内注射脂多糖（LPS）构建小鼠ARDS模型,采用气管内注射PBS作为对照组;采用胶原酶、热消化法消化小鼠肺组织获取小鼠肺单细胞悬液;双重免疫荧光染色方法鉴定小鼠肺组织中sca-1⁺CD31^-CD45^-细胞;流式细胞术对肺sca-1⁺CD31^-CD45^-细胞进行分选。采用方差分析及独立t检验进行统计学分析。 结果通过气管内注入LPS成功制作小鼠急性ARDS模型;5只小鼠的全肺组织制备单细胞悬液总数目达5×10⁷个/ml,活细胞百分比为98﹪;肺内源性干细胞包括Ⅱ型肺泡上皮细胞、clara细胞以及支气管肺泡干细胞等,通过肺组织双重免疫荧光染色,验证小鼠肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞、clara细胞以及支气管肺泡干细胞;对照组及实验组各样本肺内源性干细胞数目占单细胞悬液细胞数比例呈正态分布,且实验组肺内源性干细胞数目水平（10.73±10.65）﹪较对照组水平（12.23±0.73）﹪降低（t = -3.405,P < 0.01）。 结论ARDS时,小鼠肺内源性干细胞（sca-1⁺CD31^-CD45^-）水平降低,减少的肺内源性干细胞具体去向尚不明确,其有可能参与机体急性炎症过程中气道上皮细胞的修复、再生过程。     

外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架效力测试实验方法的研究

摸索改进外用红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)细胞壁骨架的两种效力测试方法,即流式细胞术-荧光微球法、流式细胞术-免疫双标法(荧光微球+荧光抗体),并与国家食品药品监督管理局原审批方法进行比较,经过统计学评估,评价两种方法的可行性.通过抽取小鼠免疫后获得的腹腔液注入到流式细胞仪,在发射光的荧光通路中,检测巨噬...     

微生物流式分选的单细胞样品制备及存活率提高的方法优化

【背景】以流式细胞技术为代表的高通量筛选技术能够高效筛选具有目标性状的微生物工程菌株。在流式分选中微生物的粘连会造成分析数据不准确,分选纯度降低,因此快速简便的单细胞样品制备是流式检测的关键。优势菌大多是通过筛选偶联荧光蛋白的随机突变库获得,阳性率低,杂质和死细胞的自发荧光较强,容易混入分选门内造成存活率降低,亟须提高分选存活率的方法。【目的】建立一种简便的微生物流式分选的单细胞样品制备方法,并通过碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色提高分选样品存活率。【方法】分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和酵母菌4种底盘细胞中探索超声波、消化酶、表面活性剂及超声-表面活性剂联合作用4种方式对单细胞制备效率的影响。提高微生物流式分选存活率,用常压室温等离子诱变(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)技术处理含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的酿酒酵母HZ848 (简称HZ848-GFP),形成不同强度GFP文库后,按照GFP强度分选全细胞和PI染色阴性细胞的前0.5%,统计单细胞存活率。【结果】酵母细胞分散条件为：0.01% Tween-80联合超声1 min,单细胞率达到88%以上,PI染色细胞破损率＜1.4%。谷氨酸棒状杆菌单细胞分散条件为：0.01% Tween-80联合超声5 min,单细胞率达到97%以上,PI染色细胞破损率＜1%。分选存活率结果表明,未用PI染色的酿酒酵母分选后单细胞存活率是4.3%,用PI染色去除死细胞后再分选单细胞存活率是18.3%,后者是前者的4.3倍,且具有显著性差异。【结论】本研究为微生物流式分选建立了一套简单快捷的单细胞样品制备方法,证实了PI染色法能够显著提高分选样品存活率。     

解离增强镧系元素荧光免疫分析灵敏度的改进

为提高解离增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)的灵敏度或信／噪比,进行了一些重要的方法学研究．观察到了对于不同的铕量,荧光响应和信／噪比都随着增强液体积而明显地变化．对于确定的铕量,存在一个最佳体积,且铕量越小,其最佳体积也越小．实验中选择最佳体积是重要的．研究了增强液制备技术,发展了微滴定板条有效的清洗和干燥方法,使本底荧光明显降低．     

单细胞凝胶电泳技术操作方法介绍

单细胞凝胶电泳技术是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术。具有简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记等特点。介绍其实验方法并就细胞悬液和胶板的制备,裂解、解旋和电泳,中和和染色,图像分析等操作步骤和方法予以介绍。     

基于流式细胞术的乌饭树核DNA含量(2C-值)测定

核DNA含量(2C-值)是描述植物生物多样性的一个重要特征参数。该研究利用流式细胞仪检测越橘属植物乌饭树核DNA含量,建立了适合乌饭树的流式细胞术测定方法:以野生乌饭树的嫩叶为材料,以已知核DNA含量的水稻品种‘日本晴’为内标,采用GPB解离液,细胞核悬液加入50μL獉mL-1碘化丙啶染色5 min即可上机检测。结果表明:(1) 9个乌饭树单株的核DNA含量平均值为(1.22±0.03) pg,最小值为1.18 pg,最大值为1.27 pg。(2)检测结果与已知的越橘属二倍体植株的2C-值含量相似,且不同地理来源的单株DNA含量没有显著差异(P>0.05),推测这9个单株为二倍体植株。(3)测定的乌饭树核DNA含量(2C-值)可丰富越橘属植物的C-值库;基于流式细胞术建立的乌饭树核DNA含量测定方法可为该属其他植物的相关研究提供借鉴。     

抗生素效价测定实验的几点改进

抗生素效价测定是本科实验教学中常见的实验,但目前常用实验步骤复杂,影响实验结果的因素多,造成实验重复性不高。针对这一问题,参照有关文献从制备菌悬液、制备上层培养基菌层、抑菌圈打孔方法和抗生素加注几个方面进行改进。结果表明改进后的方法操作简便,重复性好,收到了良好的实验教学效果。     

玉兰亚属多倍体植物DNA C-值流式细胞术测定体系的建立

通过对不同解离液和内标组合的筛选,采用流式细胞仪对木兰科玉兰亚属(subgen. Yulania) 6种多倍体植物的DNA C-值进行测定与分析。结果显示:在解离液和标样的筛选中,WPB解离液为玉兰亚属植物的最佳选择;以星花玉兰(Magnolia stellata(SieboldZucc.) Maxim.)为内标时,混合样品的峰图效果最好,DNA峰的变异系数(CV)均小于5.0%。紫玉兰(M. liliiflora Desr.)、多瓣紫玉兰(M. polytepala Law,R. Z. ZhouR. J. Zhang)、黄山玉兰(M. cylindrica E. H. Wilson)、白玉兰(M. denudata Desr.)、二乔玉兰(M.×soulangeana Soul.-Bod.)和渐尖玉兰(M. acuminata (L.) L.)的C-值大小范围在(3.92±0.02) pg到(5.85±0.03) pg之间,基因组大小从(3832.13±24.67) Mbp到(5964.17±56.06) Mbp。研究结果表明该优化的流式细胞术测定体系可以精确测定玉兰亚属多倍体植物的DNA C-值。     

新鲜肺癌组织的DNA 含量分析

目的：研究新鲜肺癌组织的DNA含量。方法：采用流式细胞术对30例新鲜肺癌组织和5例正常对照组组织制成的单细胞悬液进行了DNA含量分析。结果：肺癌组G0／G1、S、G2／M各时相比率和细胞增殖指数以及DNA指数与对照组存在显著性差异（P〈0．01）。结论：肺病变组织细胞DNA的流式细胞术分析是判定肺部肿瘤恶性化的敏感指标。     

质谱流式技术用于单细胞检测

质谱流式技术(mass cytometry)是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术,能够在单细胞水平实现超过50种标志物的同时测量,显著增强了对细胞生长进程和复杂细胞系统的评估能力。该文简要介绍了质谱流式技术的基本工作原理,并从金属元素标记、质量分析器、高维单细胞数据处理等方面展开论述,阐明设计新型金属元素标签和选择飞行时间质谱的必要性,归纳分析高维单细胞数据的算法并总结各种算法的优点和局限性。     

网状纤维染色中银氨离子的解离规律

目的 阐明网状纤维染色中银氨离子[Ag(NH3)2+]在蒸馏水中的解离规律,提高网状纤维染色的稳定性及一致性.方法 收集江门市中心医院病理科10例肝脏手术切除石蜡标本,采用改良Gordon-Sweets法进行染色,银氨液反应后置于蒸馏水中浸洗不同的时间以获得最佳的解离点,并在中山大学肿瘤防治中心146例肝癌病例中进行验...