尿素对热带假丝酵母Candida tropicalis合成长链二元酸途径的调节 Ⅱ.几个关键酶活力的消长

前文已报道尿素及尿素结构类似物对长链二元酸的合成酶系既有抑制作用,也有阻遏作用,从而调节了长链二元酸的合成。本文进一步从离体酶系探索过量尿素对热带假丝酵母在烃类氧化过程中有关三羧酸循环,乙醛酸循环,呼吸链,ω和β氧化等几个关键酶活力的消长关系。实验结果证明,过量尿素(0.2%)以上培养菌体的三羧酸循环三个主要脱氢酶,苹果酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶(NADP)的比活力分别为正常尿素(0.1%)培养菌体的5.3、3.0、1.7倍。乙醛酸循环关键酶,异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶分别为正常尿素培养物的2.6和2.8倍。另一方面当尿素过量时ω-氧化酶系活力极微,而β-氧化酶系活力大大提高,以致长链二元酸难以积累。另外过氧化氢酶活力在过量尿素存在时也有显著提高。而谷氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和由NAD连结的异柠檬酸脱氢酶在两种菌体内无明显差别。     

尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)合成长链二元酸途径的调节 Ⅰ.抑制和阻遏作用

尿素明显地影响热带假丝酵母的长链二元酸合成。当存在适量尿素(0.1％)时,长链二元酸大量合成,但当尿素量增加至0.2％以上时,长链二元酸基本上不积聚,但短链二元酸,主要是庚二酸有所增加。 尿素的利用呈S形曲线,说明尿素可能经酶的诱导利用。在发酵中当尿素量增至0.2％以上时,整个发酵过程均残留少量尿素,它对长链二元酸的合成起着调节作用。 发酵中加入和尿素含氮量相当的酒石酸铵或硫酸铵以代替尿素,或在适量尿素的发酵过程中,补加入和0.1％尿素含氮量相当的氨时,均不明显抑制长链二元酸的合成,但在不同时间补加入0.1％尿素时,则受强烈抑制。 适量尿素(0.1％)培养的休止菌体,在不同时间补加尿素都显著抑制长链二元酸的合成,表明尿素对已生成的酶系具有抑制作用。但过量尿素培养的休止菌体,不能转化烷烃生成长链二元酸,说明过量尿素所培养菌体的长链二元酸合成酶系受到显著的阻遏作用。 适量尿素培养的休止菌体,在不同时间加入氨,它的抑制作用远较尿素为低。用适量尿素含氮量相当的铵盐培养的休止菌体,亦具有类似现象,但过量氨培养的休止菌体转化时仍能生成多量长链二元酸。以上均说明尿素对长链二元酸合成的影响不是氨而是尿素分子本身起了抑制和阻遏作用。 尿素分子的化学结构类似物——硫脲和胍也具     

尿素对热带假丝酵母合成长链二元酸途径的调节III．菌体生长和碳代谢平衡

本文通过热带假丝酵母(Candida tropicalts)在不同量尿素中的生长、磷和碳代谢方面的研究来探讨尿素的调节作用。结果指出,过量尿素(0 3％)培养1 20小时的酵母凶体干重为适量尿素(0．1％)培养的菌体干重的162％,但二元酸及其它代谢产物的量却大为减少。发酵过程氧的吸收和二氧化碳的释出明显地高于0.1％尿素的发酵过程。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅱ)热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体的诱变育种

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79经 MNNG诱变后获得产长链二元酸突变株N—26,十三烷1:13二羧酸产量为10克/升。N-26％用秋水仙碱和樟脑分别诱发产生多倍体细胞 NP_(CO)2和NP_(Oa)18,十三烷1:13二羧酸产量分别提高到17.3克/升和18.3克/升。多倍体NP_(CO)2和NP_(Oa)18的个体大,生长速率快,DNA含量分别为3.2×10~(-6)微克/细胞和4.O×10~(-6)微克/细胞,而 N-26则为1.6×10~(-6)微克/细胞。 多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18对MNNG均较敏感,致死率较N—26高一倍,诱变之总突变频率则较原种高8—10％,以0.25毫克/毫升MNNG处理时正突变频率可提高一倍左右,因此获得高产突变株的机率显著提高。从多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18经0.25毫克/毫升MNNG处理所得高产菌株、NP_(CO)N22和 NP_(Oa)N39,十三烷 1:13二羧酸的产量分别提高到33.5克/升和34.5克/升。 对多倍体高产变种生理特性的初步观察指出多倍体细胞较易为蜗牛细胞壁溶解酶作用生成原生质体,电子显微镜初步观察指出多倍体细胞的细胞壁可能较薄。 离体酶活力的测定指出多倍体变种的三羧酸循环酶系、呼吸链酶系和过氧化氢酶活力增加,因而推测多倍体变种之所以提高长链二元酸的产量可能是由于ATP的供应增加,促进了烷烃的氧化,而过氧化氢酶的增加可能是对于烷烃氧化过     

丙氨酸对热带假丝酵母NPcoN22长链二元酸发酵的调节

本文研究了丙氨酸对热带假丝酵母(Candida tropicalis)NPcoN22长链二元酸发酵的调节,并把它与尿素的调节作了比较。在蔗糖利用、烷烃利用、菌体生长、发酵液pH变化和十四烷一1,14一二羧酸积累诸方面以及在三羧酸循环、乙醛酸循环、过氧化氢酶等酶的活力方面,丙氨酸具有与尿素相同的调节作用。丙氨酸加尿素作为混合氮源或在正常发酵过程中补加尿素或丙氨酸,其调节效果与过量尿素或过量丙氨酸单独存在条件下的情况一样,说明尿素和丙氨酸的调节作用具有相加效应。发酵过程中菌体对丙氨酸的利用特点表明了丙氨酸是菌体生长的限制因子。Β一氧化的抑制剂——丙烯酸能显著提高十四烷一1,14-二羧酸的积累。     

N~ 离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产量的影响

用热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＳＣＢ４１２作为出发菌株,经能量５０ＫｅＶ、剂量１× １０~１１～５ ×１０~１５ ｉｏｎｓ／ｃｍ~２的Ｎ~＋离子注入诱变处理,以产生可遗传的诱变。 Ｎ~＋离子注入后,存活率与剂量呈指数衰减关系：ｌｏｇ（存活率％）＝ ８．２３－ ０．６０４ × ｌｏｇ（剂量）,在培养过程中可观察到酵母菌菌落和细胞形态均发生了变化。经筛选,获得了一株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌热带假丝酵母ＳＣＢ６０９。在初始正十二烷烃浓度为１５％（ｖ／ｖ）下产酸量由４３．５ｇ／Ｌ上升到７３．２ｇ／Ｌ。比较两株菌发酵生长特性的差异,产酸过程有一定的变化。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅳ)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)休止细胞转化正烷烃为相应长链二元酸的研究

热带假丝酵母(Candida tropicalis)变种N-15的休止菌体能转化十五烷为十三烷1:13二羧酸。菌龄48小时休止菌体转化活力最高。转化的最适反应系统为pH 7`5之0`5 M磷酸缓冲液。通气量对转化有很大影响,在高通气条件下,菌浓为15×10~8/毫升时,十三烷1:13二羧酸产量可高达109克/升。而且休止菌体可将从癸烷至十七烷的正烷烃氧化为相应碳链的长铸二元酸,产量都很高。转化的方法工艺简单,效率高,有应用价值。N-15休止菌体还可以氧化不同长度碳链的醇、醛及一元脂肪酸,但不能氧化烯烃及二元醇,可能N-15的烷烃初始氧化不经过脱氢及二元醇氧化途径。     

产长链二元酸热带假丝酵母酸分泌过程研究

热带假丝酵母（C．tropicalis）是长链二元酸发酵生产中常用菌种。其二元酸分泌过程是烧烃代谢过程中的重要步骤,pH在7．4～8．2范围内,足够高的pH对分泌和产酸是必需的。二元酸钠盐明显不利于分泌过程。二元酸的分泌相对于胞内ω一氧化过程是快速过程。建立了一种用于研究分泌过程的方法,利用静息细胞在缓冲溶液中分泌所引起的溶液pH变化来获得酸分泌量的在线数据。     

尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种形成微体的影响

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(co)N22的超显微形态、结构和长链二元酸合成的关系进行了研究。烷烃能诱导热带假丝酵母微体(microbody)的形成。在适量尿素(0.1％)存在下的烷烃发酵能合成大量长链二元酸,同时菌体内有很多微体出现,但在过量尿素(0.2％)存在下,则长链二元酸的合成和微体的形成均受抑制,说明微体的存在是长链二元酸合成的必要条件。由于微体对烷烃的利用和长链二元酸的合成有关,ω氧化酶系也可能定位于微体上。 在过量尿素(0.2％)存在下,微体的形成和长链二元酸的合成都被抑制,尿酸氧化酶也明显降低,但过氧化氢酶和D-氨基酸氧化酶都比适量尿素(0.1％)培养的菌体显著增加。这些结果指出,微体的出现和这三种所谓微体的“标志酶”的活力是不平行的。因此“标志酶”的提法值得商榷。     

N^＋离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产量的影响

用热带假丝酵母(Candidatropicalis)SCB412作为出发菌株,经能量50KeV、剂量l×1011～5×1015ions/cm2的N+离子注入诱变处理,以产生可遗传的诱变.N+离子注入后,存活率与剂量呈指数衰减关系log(存活率%)=8.23-0.604×log(剂量),在培养过程中可观察到酵母菌菌落和细胞形态均发生了变化.经筛选,获得了一株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌热带假丝酵母SCB609.在初始正十二烷烃浓度为15%(v/v)下产酸量由43.5g/L上升到73.2g/L.比较两株菌发酵生长特性的差异,产酸过程有一定的变化.     

石油发酵长链二元酸的研究——Ⅲ.热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种生产十三烷1∶3二羧酸的发酵条件研究

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(CO)N22的十三烷1:13二羧酸高产发酵进行了研究。乙醇、可溶性淀粉、尿素、磷酸氢二铵等为较好的碳、氮源,但尿素等氮源的量增加时则完全抑制了二元酸的合成。烷烃发酵的适宜起始pH值在6～7之间,而发酵过程中则以维持pH值在8～8.5为佳。通气量Ks=0.8毫克分子O_2/升/分时,二元酸的产量最高。苯巴比妥和巴比妥酸钠能明显促进二元酸的合成。以乙醇和蔗糖为碳源,结合补料及调节pH,发酵190小时,十三烷1:13二羧酸产量分别达77.2克/升和72.5克/升。热带假丝酵母多倍体变种能氧化从癸烷至十八烷的正烷烃为相应碳链的长链二元酸,但以十三烷1:13二羧酸的产量为最高。     

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79微体蛋白质组分的分析研究

纯化的微体,经过渗透休克、反复洗涤,被分成微体膜和可溶性组分两部分。它们的蛋白质含量分别占微体蛋白质总量的70%和30%左右。酶学分析表明,过氧化氢酶和尿酸氧化酶主要分布在微体可溶性部分,NADH-细胞色素c还原酶(抗霉素不敏感型)可能是与微体膜相连结的蛋白质。用淀粉凝胶分离、普鲁士蓝染色的方法,在微体可溶性部分检出两种不同类型的过氧化氢酶。经SDS-PAGE分析,微体膜显示出25条蛋白亚基带,可溶性部分显示出21条蛋白亚基带。微体蛋白亚基分子量范围在14K～140K之间。其中,33K蛋白亚基是微体膜的主要结构蛋白;24K、26K和33K蛋白亚基为糖蛋白;63K和36K蛋白亚基分别是过氧化氢酶和尿酸氧化酶。在双相凝胶电泳图谱上,微体膜出现110个斑点,可溶性部分出现59个斑点。过氧化氢酶和尿酸氧化酶在双相凝胶电泳图谱中的位置都已确定。采用交叉免疫电泳的方法,研究了微体蛋白质在酵母生长过程中的变化。结果表明:热带假丝酵母79培养18小时,微体发育成熟;36小时后,微体开始降解。     

热带假丝酵母ctpxa1基因缺失菌的构建及对长链二元酸积累的影响

Pxa1p为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae过氧化物酶体上的膜蛋白,与Pxa2p组成二聚体,参与转运长链脂肪酸进入过氧化物酶体过程。热带假丝酵母能够发酵烷烃和脂肪酸生产长链二元酸,而过氧化物酶体中发生的β-氧化会消耗产生的长链二元酸造成产率降低。本研究以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798为宿主菌,通过基于PCR片段的同源单交换法,快速构建ctpxa1基因敲除菌株C.tropicalis 1798-pxa1。利用半定量RT-PCR技术,检测ctpxa1基因在C.tropicalis 1798、C.tropicalis 1798-pxa1的表达量,灰度值比值为2.03,表明ctpxa1在C.tropicalis 1798-pxa1中的表达被弱化。经144 h发酵,C.tropicalis 1798-pxa1比C.tropicalis 1798的十二碳二元酸产量明显提升,其产出浓度为10.3 g/L,比野生型菌株C.tropicalis 1798提高了94.3%。     

热带假丝酵母长链二(脂)酰辅酶A合成酶的形成及性质

热带假丝酵母(Candida tyopicalis)具有不同碳链的二(脂)酰CoA合成酶的活力,原始菌No．1230的十二二酰CoA合成酶的活性较其突变株U3-21。高近一倍。生长碳源对酶的形成有一定的影响。十二二酰CoA合成酶需有ATP、CoASH才显示活性。酶作用的最适pH在6—8,最适温度为30℃。该酶耐热性极差,50℃,5分钟酶活全部丧失。ADP、AMP、KF、Zn2+ 及 8-羟基喹啉、2,4-二硝基苯酚、高浓度的EDTA和尿素对酶活性有抑制作用。     

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79微体(microbody)分离与特性的研究

本文报道利用正十五烷热带假丝酵母Candida tropicalis 79微体的诱导和分离。用分级离心和非连续蔗糖密度梯度离心技术,从对数生长期前期的热带假丝酵母原生质体中分离得结构完整的微体。经酶学和细胞化学分析表明,微体中具有很强的过氧化氢酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶等活力和使3,3′-二氨基联苯(DAB)氧化聚合的能力,证实了过氧化氢酶等主要定位在微体上。电镜观察,微体是单膜结构的细胞器,在某些微体的基质中尚见到晶核(crystalline core)和类晶体(crystallo-id)等细微结构。微体中尚含有一定量的脱氧核糖核酸,提示了微体有遗传功能的可能性。     

产二羧酸热带假丝酵母乙酰CoA合成酶的研究

测定了利用正烷烃积累相应链长二羧酸的热带假丝酵母(Candida tropicalis)突变株U3-2及其亲株Nn,1230乙酰Coa合成酶的活力。该酶反应的最适pH为6．8;作用于醋酸盐的K。值为l㈨01『L;此酶对热极不稳定,突变栋的酶较亲株尤甚o 300c保温半小时,前者的酶活力丧失l 8％,后者丧失50％;保温两小时后,前者丧失5 5％,而后者丧失95％的活力。亲抹乙酰c。A合成酶活力比突变株的高一倍。也j兜察到突变株的生长比亲林慢得多。因此在用突变株u;一菌发酵正烷烃生产二羧酸时,应适当延长种子的培养时间。     

N+离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产量的影响*

用热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＳＣＢ４１２作为出发菌株,经能量５０ＫｅＶ、剂量１× １０^１１～５ ×１０^１５ ｉｏｎｓ／ｃｍ^２的Ｎ^＋离子注入诱变处理,以产生可遗传的诱变。 Ｎ^＋离子注入后,存活率与剂量呈指数衰减关系：ｌｏｇ（存活率％）＝ ８．２３－ ０．６０４ × ｌｏｇ（剂量）,在培养过程中可观察到酵母菌菌落和细胞形态均发生了变化。经筛选,获得了一株能够利用     

产甘油假丝酵母甘油合成关键酶编码基因的克隆

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)作为优良的甘油生产菌株已经成功应用于工业化生产。但相对于酿酒酵母, 该菌株的耐高渗机理和甘油代谢的分子机制还不甚清楚。本文根据已公布的3-磷酸甘油脱氢酶基因的序列信息, 设计出一组寡核苷酸, 再运用简并PCR结合反向PCR技术从C. glycerinogenes的基因组DNA中获得了4 900 bp的核苷酸序列, 递交GenBank (No. EU186536)。该序列包含完整的编码胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD)开放阅读框及其上、下游调控序列。1 167 bp的开放阅读框编码388个氨基酸残基的蛋白。所演绎出氨基酸序列分析比对结果表明该基因产物的序列具有典型的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶结构特征, 但与已鉴定的相关基因存在中等程度的同源性并在相应的辅酶催化位点和底物结合位点区域具有高度的保守性, 在氨基酸水平上与安格斯毕赤酵母的相似性最高, 达到70.9%。该基因在Saccharomyces cerevisiae W303A中异源表达能够显著提高细胞的甘油合成能力。     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅱ.酶的性质和调节

头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)生物活性的最适pH为7。测活系统中必须加入Mn~(2 )或Mg~(2 ),二者分别作激活离子时得到的酶的参数不同。Mn~(2 )对GS有稳定作用。一些金属离子如Ca~(2 )等强烈地抑制生物活性。GS的最适温度为50℃,对ATP、谷氨酸和NH_4Cl的Km值分别为1.75、2.78和5mmol/L。NH_4Cl的浓度小于10mmol/L时对酶有正协同效应,大于10mmol/L时对酶有负协同效应。GS可被氨阻遏,比活能被硝酸盐促进。一些代谢物对GS有累积反馈抑制作用。发酵过程中加入氨后无“氨休克”现象,高氨条件下的GS不受蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)的作用,所以此酶无腺苷酰化—去腺苷酰化调节。     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅱ.酶的性质和调节

头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)生物活性的最适pH为7。测活系统中必须加入Mn~(2+)或Mg~(2+),二者分别作激活离子时得到的酶的参数不同。Mn~(2+)对GS有稳定作用。一些金属离子如Ca~(2+)等强烈地抑制生物活性。GS的最适温度为50℃,对ATP、谷氨酸和NH_4Cl的Km值分别为1.75、2.78和5mmol/L。NH_4Cl的浓度小于10mmol/L时对酶有正协同效应,大于10mmol/L时对酶有负协同效应。GS可被氨阻遏,比活能被硝酸盐促进。一些代谢物对GS有累积反馈抑制作用。发酵过程中加入氨后无“氨休克”现象,高氨条件下的GS不受蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)的作用,所以此酶无腺苷酰化—去腺苷酰化调节。