天坛株痘苗病毒载体研究与应用概述

1982年,文献首次报道外源基因成功在痘苗病毒WR株（小鼠嗜神经毒株）中获得表达,引起了中国科学家的极大关注。1984年,中国医学科学院病毒学研究所在朱既明院士的组织下成立了痘苗病毒基因表达载体研究协作组,提出使用天坛痘苗病毒疫苗株开发可用于人体的痘苗病毒基因表达载体的新思路。该研究历时10余年,成功构建了痘苗病毒天坛株高效表达载体,并广泛用于外源基因表达、基因工程疫苗研究、单克隆抗体研制和诊断试剂开发。本文简单介绍了该载体的研究及应用,并对载体疫苗存在的问题及发展前景进行了讨论。     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D的重组活疫苗的建立

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１－１６８株）病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的１．２ｋｂ片段,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的质粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达分子量为５４ｋＤ糖蛋白。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析了重组病毒ＤＮＡ中特异的ｇＤ基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒I型糖蛋白D的重组活疫苗…

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ｉ型病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ基因的１．２ｋｂ片估,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的持粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原供细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。     

痘苗病毒天坛株非必需区TA25R…TA36L的两步重组表达载体的构建

针对痘苗病毒天坛株非必需区ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ,构建了可去除ＴＡ２６Ｒ至ＴＡ３５Ｌ的１０个ＯＲＦｓ,并同时表达ＬａｃＺ的两步重组表达载体ｐＡ２４２７ＬａｃＺ。通过两种方法（一步重组和两步重组）获得了在该区域表达ＬａｃＺ基因的重组痘苗病毒ＲＶＡ２４２７Ｌdisplay status     

适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建

为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75.为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞.筛选得到的重组病毒经PCR和Dot blot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上.Westem blot检测结果表明,目的基因的表达正确.痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考.     

痘苗病毒载体在病毒疫苗研制中的应用

痘苗病毒载体在病毒疫苗研制中的应用孙劲（中国预防医学科学院病毒研究所,北京１０００５２）随着分子生物学技术的发展及日臻完善,病毒疫苗的制备出现了一些新的动向,继亚单位疫苗、多肽疫苗和抗独特型抗体疫苗之后,又出现了重组病毒活疫苗,即应用基因工程技术,以...     

痘苗病毒载体在病毒疫苗研制上的应用

痘苗病毒作为真核表达载体已广泛应用于外源基因的表达,并日益受到重视,本文就痘苗病毒的生物学特性,重组痘苗病毒的构建原则,外源基因在重组痘苗病毒中的表达情况及重组痘苗病毒作为活疫苗的优缺点等方面作一概括性综述。     

非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究

将反向串联的痘苗病毒启动p11k和p7.5k表达结构引入非复制痘苗病毒质粒载体,得到非复制痘苗病毒表达载体pNEOCK11β75、pNEOCK7511β、pNEOCK1175和pNEOCK7511。利用载体pNEOCK11β75、pNEOCK7511β及pNEOCK11β75IL6和RVJ123重组病毒进行同源重组,分别得到非复制重组痘苗病毒RVJ123△11β75、RVJ123△7511β和RVJ123△11β75IL6。Southern-blot证实：重组病毒RVJ123△11β75 C－K片段间大片段基因的稳定缺失,同时β－半乳糖苷酸基因插入到缺失区内并稳定表达,不影响另外非必要区外源基因的表达,缺失区内两外源基因的表达夫相互干扰,并且缺失区内外源基因的转录方向对其DNA复制及蛋白表达以及另外非必要区基因的表达无影响。     

用免疫蚀斑方法筛选重组痘苗病毒疫苗株

用间接免疫酶方法在硝酸纤维膜上检查,筛选和回收重线痘苗病毒。作为人用疫苗株的筛选,此法较核酸杂交方法更简便,直观和准确,在筛选重组病毒的同时确定了病毒在感染细胞上的表达。构建了含痘苗病毒７．５Ｋ启动子和ＥＢ病毒膜抗原基因的转移载体,从转染的病毒混合液中用特异性ＭｃＡｂ和间接免疫酶方法直接筛选表达ＥＢ病毒膜抗原的重组痘苗病毒,并从阳性酶斑中回收具感染性病毒。     

表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pV175转移质粒,并将HIV—I中国主要流行株B’／C重组株CN54 gagpol基因置于pV175的启动子pE／L下,构建重组质粒pVl75—Gagpol。重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞。前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒。结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失;PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Westem blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白。     

采用我国痘苗病毒天坛株载体表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D

木文从单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)基因组EcoRI H片段中分离出含有糖蛋白D(gD)基因的2.5kb DWA片段,插入带有痘苗病毒天坛株TK基因区段的pJC—2质粒p7.5k启动子的下游,转染TK~-143细胞,获得带有HSV-1 gD基因的重组痘苗病毒。采用HSV-1 gD单克隆抗体免疫胶体金技术进行电镜观察表明,重组痘苗病毒感染的细胞内有特异性HSV-1 gD抗原.重组病毒免疫家兔后6周可产生明显的HSV-1中和抗体。     

表达HIV-1多价合成基因的重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制适合我国使用的HIV疫苗,选择具有代表意义的中国流行株HIV CN54(B′/C)病毒gag、pol、nef等基因的合成基因syngpnef,插入到自行构建的能在病毒筛选过程中将标记基因去除掉的双标记基因痘苗病毒载体pVI75的KpnI酶切位点,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,与我国的天坛株痘苗病毒共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝白斑筛选得到的重组病毒疫苗株DNA。经PCR鉴定标记基因已被删除并有目的基因的整合,Western blot可检测到目的基因的融合表达。此重组病毒疫苗株有望成为HIV/AIDS候选疫苗。     

溶瘤痘苗病毒的研究进展

溶瘤病毒可靶向性杀伤肿瘤细胞而不对正常细胞产生杀伤作用。近几年已开发出十余种溶瘤病毒。痘苗病毒曾在全球消灭天花行动中被广泛使用,并且有着复制速度快、免疫原性强、副作用明确等优点。痘苗病毒经过基因改造,可以选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解细胞。目前,用于溶瘤痘苗病毒改造的主要有痘苗病毒Western Re verse株、Wyeth株、Lister株和Copenhagen株,我国使用的痘苗病毒天坛株尚未有相关报道。     

重组痘苗病毒(RVV)表达载体系统研究进展

天花是烈性传染病,曾在历史上给人类带来过极大的苦难。早在1798年,英国医生Jenner首次报导采用牛痘病毒进行皮肤划痕,可以予防天花病毒的感染。这一发现为全球消灭天花发挥了极为重要的作用。     

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法,对HPV581L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰,并保留氨基酸不变.选用非复制型重组痘苗病毒为载体,将修饰的L1基因1.5kb和L2基因1.4kb分别插入痘苗病毒表达载体pJSD的7.5k和H6早期启动子之后,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组.经单斑筛选纯化,获得共表达HPV58L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株.该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交分析,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV581L1及L2蛋白.此结果为HPV58型非复制型重组痘苗病毒疫苗人用株的研究打下了基础.