人类巨细胞病毒感染树鼩原代真皮成纤维细胞诱导凋亡特性

人类巨细胞病毒(HCMV)流行广泛,危害严重,由于其严格的物种特异性限制,动物模型缺乏,严重阻碍了对其致病机制的研究及药物、疫苗的研发。本研究对树鼩(Tupaia belangeri)来源的原代真皮成纤维细胞感染HCMV后的细胞死亡现象进行了初步探索。首先,观察了感染后细胞病变和死亡情况,使用细胞增殖检测试剂盒测定了细胞活力;其次,对凋亡相关因子bax、bcl-2和未折叠蛋白反应相关因子chop、atf4、xbp1s转录水平的差异进行了逆转录荧光定量PCR检测与分析;然后利用免疫蛋白印迹技术检测并分析了主要病毒蛋白IE1、UL44和凋亡相关因子Bax、Caspase-9、Caspase-3、PARP的表达水平;最后结合膜联蛋白-V和碘化丙啶双染色法从生物化学角度对细胞死亡类型进行了鉴定。结果显示,细胞病变和死亡情况随着感染进程逐渐严重,细胞活力下降明显(P 0.001)。感染上调bax、bcl-2、chop、atf4、xbp1s转录水平并且使bax与bcl-2转录水平呈明显拮抗趋势;感染同时上调Bax、Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白表达和逐级剪切激活;病毒蛋白IE1、UL44可以上调至一个完整的病毒复制周期结束。综上,本研究指出HCMV跨物种感染树鼩原代真皮成纤维细胞可诱导细胞凋亡,并且与内质网和线粒体密切相关。     

水牛皮肤成纤维细胞的分离与体外培养

探讨水牛成纤维细胞的分离与传代培养方法。组织块培养法培养的成纤维细胞原代生长较慢,需12天左右方可汇合形成单层,而酶消化法培养的成纤维细胞原代生长相对生长快,仅需8天便可汇合形成单层。两种方法传代细胞的生长速度相似,仅需4-5天就可汇合形成单层。通过体细胞的核型分析发现,成纤维细胞在传代培养过程中的核型变化不大,66．67％～81．67％的细胞具有正常的二倍体核型,各代之间无显著差异。结果表明,水牛成纤维细胞均能稳定地进行传代培养。     

两种原代树鼩肝细胞的分离和培养方法的研究

目的 探讨体外原代培养树嗣肝细胞的分离方法.方法 以成年树鼩和新生树鼦做为肝供体,分别采用体外两步灌流法和Percoll梯度液离心方法获取肝细胞并进行体外培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在相差倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测培养细胞活性,并采用PAS染色法鉴定.结果 分离收获成年树鼩肝细胞较新生树鼩肝细胞存活率高;培养过程中,新生树胸肝细胞较成年树鼩肝细胞生长快,增殖能力强,具有统计学意义;PAS染色观察,新生树鼩和成年树鼩的肝细胞中充满大量糖原颗粒,两者差异无显著性.结论 两种方法均可用于原代树鼩肝细胞的体外培养.     

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

新生大鼠肺成纤维细胞的原代培养改良法及细胞鉴定

探讨新生大鼠肺成纤维细胞原代培养的改良方法及细胞鉴定。用胰酶消化组织块结合的方法提取新生大鼠肺成纤维细胞,并纯化细胞,对肺成纤维细胞进行形态学观察,用HE染色及免疫组化染色法对细胞进行鉴定,并用MTT法测定细胞生长曲线。倒置相差显微镜下观察选用改良法获得的细胞,3 d后可见组织块周边有少许细胞,5 d后组织块周围有大量细胞爬出,生长迅速,10 d接近融合。经改良后的方法纯化细胞,细胞活性状态较好的为3~5代,5代以后的细胞增殖能力下降。对第3代肺成纤维细胞进行HE染色,镜下可见形态典型的成纤维细胞,免疫组化结果显示波形蛋白(Vi-mentin)阳性表达,细胞角蛋白(cytokeratin)阴性表达。MTT法检测第3代细胞于3~5 d处于对数生长期。胰酶消化组织块结合法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化的培养方法,使用这种方法可得到具有典型形态特征且活性较好的肺成纤维细胞,初学者容易掌握。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代。并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色。结果倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性。结论建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞。     

树鼩呼肠孤病毒的分离鉴定

致病性病毒严重危害树鼩(treeshrew,Tupaia)生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道。该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜观察显示该病毒为球形,双层衣壳,完整直径~75nm。纯化病毒经核酸PAGE电泳后呈现10个核酸节段,并为典型的3:3:4排列。哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)L1基因保守区RT-PCR检测、序列分析及进化树构建结果表明,该病毒株属于MRV,且与来源于蝙蝠的呼肠孤病毒分离株(T3/Bat/Germany/342/08)同源性最高。MRV是人兽共患病病毒,该实验首次从树鼩体内成功分离到MRV,对今后研究制定实验树鼩病毒学控制标准具有指导意义,同时为有效预防该病毒在树鼩与人类之间传播提供了实验依据。     

4℃保存的绵羊皮肤成纤维细胞的培养及冷冻

为了探讨利用死亡珍稀动物皮肤建立成纤维细胞库的方法,本研究采集幼龄绵羊耳廓皮肤,在4℃条件下保存0 h(对照组)、24 h、48 h和72 h后进行原代培养,达到85%汇合后再进行了继代培养或者经冷冻-复苏后继代培养。结果:(1)与对照组相比,各保存组皮肤成纤维细胞经原代培养后达到85%汇合时间滞后(分别为4 d和8d~15 d);(2)各保存组成纤维细胞经4代培养后,与对照组继代培养达到85%汇合时间相同(对照组继代培养第1~4代均为4 d);(3)原代培养成纤维细胞通过冷冻-复苏后经第2代培养,即可在4 d内均达到85%汇合。表明动物死亡后立即采取其耳廓皮肤并在4℃下保存一段时间后,经原代培养和继代培养,或经原代培养、冷冻-复苏和继代培养,可获得具有正常继代能力的成纤维细胞。     

原代培养的二倍体上皮细胞和成纤维细胞的纯化

人体包皮原代培养物所长出的两种细胞—上皮细胞和成纤维细胞,通过本文介绍的纯化方法可以分别收集提供不同实验的需要。如正常上皮细胞在肿瘤实验及烧伤病人植皮等方面都有一定的实用价值。而成纤维细胞在转化试验及干扰素等的制备物中都是有用的实验材     

CA16感染树鼩肺成纤维细胞模型的建立及其受体SCARB2的表达

目的 探讨建立CA16感染树鼩肺成纤维细胞(tree shrew lung fibroblasts,TSLF)实验模型的可行性。方法 用肠道病毒CA16感染TSLF,以人肺成纤维细胞(KMB-17)作对照,镜下观察细胞病变情况,间接免疫荧光实验观察病毒蛋白和感染相关受体SCARB2蛋白的表达情况,探针法实时荧光定量PCR检测病毒载量,以β-Actin作内参染料法实时荧光定量PCR检测受体SCARB2基因的相对表达量,结合基因序列比对,分析其与感染的相关性。结果 CA16感染TSLF,可引起明显的细胞病变,免疫荧光实验可见病毒和受体SCARB2蛋白,以100TCID50/10^5 cells的比例感染TSLF可在48 h左右病毒载量达到最高,SCARB2基因有与感染相关的高表达,而其基因序列也与人有较高同源性。结论 CA16可感染TSLF,树鼩SCARB2可参与感染。     

冷驯化对中缅树鼩产热能力的影响

在 ( 5± 1)℃条件下对中缅树 (Tupaiabelangeri)进行低温胁迫处理 ( 0～ 2 8d) ,测定其冷驯化过程中的静止代谢率 (RMR)、非颤抖性产热 (NSTmax)、冷诱导最大产热 (CIRMR)、体重、体温等生理指标 ,探讨低温对中缅树产热能力的影响。结果表明 :①冷驯化期间中缅树体重增加 ,体温降低 ,产热能力显著增强 ;②在冷驯化过程中 ,增加RMR和CIRMR是中缅树抵抗低温胁迫的主要产热模式。     

Tree shrew (Tupaia belangeri) as a novel laboratory disease animal model

The tree shrew (Tupaia belangen) is a promising laboratory animal that possesses a closer genetic relationship to primates than to rodents.In addition,advantages such as small size,easy breeding,and rapid reproduction make the tree shrew an ideal subject for the study of human disease.Numerous tree shrew disease models have been generated in biological and medical studies in recent years.Here we summarize current tree shrew disease models,including models of infectious diseases,cancers,depressive disorders,drug addiction,myopia,metabolic diseases,and immune-related diseases.With the success of tree shrew transgenic technology,this species will be increasingly used in biological and medical studies in the future.     

树类-细小病毒的初步研究

从树肾细胞培养物中分离出3株病毒,嗜在对数分裂期的TL细胞上复制,产生细胞病变和血凝素抗原,能凝集豚鼠和小鼠红细胞。交互血凝抑制实验表明3株病毒同属一个血清型。免疫酶染色显示抗原首先出现于细胞核。电镜观察负染标本病毒形态近似圆形和六角形,无胞膜,直径约30nm。血清学检查大多数树血清中含有该病毒抗体,证明是树的一种潜在病毒。初步鉴定为类细小病毒。     

冷暴露对中缅树鼩适应性产热特征的影响

在冷暴露(5 ± 1℃)1 d,7 d,14 d 和21d 对中缅树鼩的肝脏、心脏、膈肌、腓肠肌和褐色脂肪组织(BAT)的总蛋白和线粒体蛋白含量、线粒体的状态Ⅳ呼吸能力、细胞色素C 氧化酶活力及血清中甲状腺激素的水平等指标进行了测定。结果表明:冷暴露过程中肝脏线粒体蛋白含量对低温的反应比总蛋白的反应剧烈,心脏和BAT 组织的线粒体蛋白含量也随着冷驯化时间的延长而显著增加,但腓肠肌的反应较为温和;各组织线粒体的状态Ⅳ呼吸能力均显著增强,除腓肠肌外其它各组织细胞色素C 氧化酶活性也随冷暴露时间的延长而急剧增加。说明在低温条件下,肝脏、腓肠肌、心脏和BAT 等组织都参与了体温调节的过程,在自然生境中,低温是重要的刺激产热的调节因子。     

野生中缅鼩病毒携带情况的初步调查

病毒学检测和监测是树鼩实验动物化和质量控制的重要标准和依据,而野生中缅树鼩是否携带人兽共患病毒鲜见报道。本研究采用酶联免疫吸附(ELISA)方法,对来源于云南昆明市城郊青龙峡地区的野生树鼩是否携带单纯疱疹病毒、轮状病毒、流感病毒、柯萨奇病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、登革热病毒、出血热病毒和麻疹病毒等11种常见病毒进行筛查。结果表明,在已筛查的60只野生中缅树鼩中,可检测到单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒,其血清抗体阳性比例分别为36.7%(22/60)和1.67%(1/60),而在粪便中仅检测到轮状病毒,其抗原阳性为6.7%(4/60),未检测到其他病毒,初步显示了野生树鼩自然状态下携带病毒的状况。为此,建议将单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒和轮状病毒列为普通级树鼩病毒质量控制的首检项目,进一步大样本筛查将显示是否将其他病毒列为必检项目。     

树鼩神经肽Y的分子克隆及其灵长类类似物的同源性比较

树鼩由于与灵长类动物有较密切的亲缘关系和其个体小,以及繁殖周期短等特性而倍受关注,尤其是作为医用实验动物的研究,近年来已受到越来越多的重视,但树鼩的分类地位还一直有所争论。该研究从树鼩脑cDNA文库中克隆得到编码树鼩神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)前体序列,序列比对发现该序列与灵长类NPY序列同源性高达96.9%。将该序列与GenBank数据库中其他物种的NPY序列构建系统进化树,发现树鼩与灵长类处于同一分支。该研究结果揭示了树鼩与灵长类较近的亲缘关系。     

雌性中缅树鼩繁殖期尿液的挥发性成分分析

正动物化学通讯包含信号发出者、化学信号、信号接收者三要素。尿液、粪便及特化腺分泌物是哺乳动物的主要气味源,由醇、烷烃、酸、酯、肽、蛋白质等组成,且其化学成分较为复杂(Novotny et al.,1999;Zhao and Wang,2010;Zhang and Zhang,2011)。尿液中化学信号发挥着极为重要作用,可以编码多种信息,如编码身体质量     

中缅树鼩消化道长度和重量变化

为探讨栖息于昆明禄劝地区中缅树鼩(Tupaia belangeri)的消化道特征与环境之间的适应关系,在2008年6月和12月(夏季和冬季)分别对自然环境中缅树鼩的胃、小肠、大肠、盲肠的长度、含内容物重、去内容物重、干组织重等消化道指标进行了测定。结果表明,中缅树鼩消化道特征冬季和夏季存在变化,随着温度降低、食物质量下降,中缅树鼩的小肠长度和重量增加;各器官重量均在冬季最大;中缅树鼩在受到低温、食物质量下降等因子胁迫下,通过调节消化道长度和重量来满足能量需求的增加,维持正常的生理机能。中缅树鼩的消化道在冬季和夏季中表现出的变化模式及消化对策对其在自然环境中的生存是至关重要的。     

云南中缅树鼩线粒体细胞色素b和D-loop区遗传多样性研究

对3个地方种群的49只样本的线粒体Cyt b基因全序列（1140 bp）及33只样本的控制区D-loop基因区段（745 bp）进行了序列测定。结果表明：Cyt b基因多态性位点有47个,其中单变异位点位点23个,简约信息位点24个。共定义了24个单倍型,其中种群间的共享单倍型有2个（8.33%）,其余均为某个种群所特有,单倍型多样度范围为0.80952（剑川种群）~0.91532（禄劝种群）,核苷酸多样度指数介于0.00326（禄劝种群）~0.00635（剑川种群）之间;D-loop基因多态性位点有18个,其中单变异位点8个,简约信息位点10个。共定义了16个单倍型,无种群间的共享单倍型,单倍型多样度范围为0.76615（禄劝种群）~0.93333（丽江种群）,核苷酸多样度指数介于0.00269（禄劝种群）~0.00583（丽江种群）之间。从各单倍型的TCS网络进化图显示横断山种群位于分支的末端,表现出中缅树鼩由南向北的扩散模式,支持＂岛屿起源＂假说。