一种基于连续PMCA的PrPSc体外扩增方法的建立

为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测.结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制.连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc.     

朊蛋白体外扩增技术对不同种属朊病毒检测敏感性分析

朊蛋白体外扩增技术包括实时震动诱导蛋白扩增(Real-time quaking-induced conversion,RT-QuIC)技术及蛋白错误折叠循环扩增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)技术。为了分析朊蛋白体外扩增技术与传统的蛋白免疫印迹技术对于朊病毒毒株检测敏感性的差异，应用此三种方法对朊病毒小鼠适应株139A、ME7和S15以及仓鼠适应株263K毒株进行了检测及对比分析。结果显示，应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法，均可检测到10^-9稀释度139A小鼠脑匀浆中的朊病毒，比Western blot方法敏感度提高了10⁶倍；应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法，分别可检测到10^-7稀释度及10^-8稀释度ME7小鼠脑匀浆中的朊病毒，分别比Western blot方法敏感度提高了10⁴倍及10⁵倍；应用RT-QuIC方法以及三轮PMCA扩增方法，分别可检测到10^-...     

体外合成朊病毒的研究进展

朊蛋白疾病是人类和动物中枢神经变性的神经退行性疾病,严重威胁人类的健康。朊病毒(Prion)引发疾病的致病机理尚未十分清楚,常采用体外合成Prion的方法研究其致病机理,但体外研究朊蛋白的主要困难在于建立一个合适的系统模拟体内环境,以便研究正常朊蛋白转化为致病性朊病毒的发病机制。综述了无细胞转化分析,细胞裂解液转化分析,蛋白质错折叠循环扩增,自催化转化分析等至今普遍采用的几种Prion体外合成方法,并讨论了这些方法是否适合用于模拟Prion在体内合成并聚集的过程,为研究朊病毒疾病提供了丰富的研究资源,为深入研究朊蛋白致病性转化提供参考。     

线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone和积雪草酸对朊病毒感染的神经细胞的治疗作用研究

朊病毒病(Prion diseases)是一类具有致死性、传染性和进行性的神经退行性疾病。研究发现朊病毒感染的细胞和动物模型中均存在着线粒体功能异常和氧化应激,这很有可能在朊病毒病发生发展中起重要作用。为探究线粒体靶向抗氧化剂对朊病毒感染是否具有一定的治疗作用,我们选出两种线粒体靶向抗氧化剂,以一定浓度作用于朊病毒感染神经细胞系,并观察细胞活性和线粒体功能的变化情况。结果显示,Mitoquinone(MitoQ)和积雪草酸(Asiatic acid,AA)这两种药物能够显著提高朊病毒感染细胞的活性,降低其活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,上调ATP5β的表达水平,提示这两种药物对朊病毒感染细胞有一定的治疗作用,本研究为朊病毒病发病机制以及治疗的研究提供了新的思路。     

朊蛋白PrP~C与神经元的凋亡和存活

朊病毒是不含核酸的一种蛋白质感染颗粒,感染宿主后可诱导细胞固有的同类朊蛋白(PrPC)构象改变、转化成具有蛋白酶抗性的致病性朊粒蛋白(PrPSc),导致可传播性海绵状脑病的发生.PrPC既作为朊病毒复制和疾病发生的分子基础,又是正常的细胞膜蛋白,作为细胞信号转导的参与者调控多条信号通路.因此,揭示PrPC在各条信号途径中发挥的作用将有助于深入了解PrPC的生理功能,进一步理解疾病发生发展过程,为今后的诊断治疗奠定基础.     

羊瘙痒因子263K感染仓鼠临床终末期脑中αB-晶体蛋白表达的研究

αB-晶体蛋白(αB-crystallin)是小热休克蛋白(Small heat shock protein,sHSP)家族的代表成员,已发现与多种神经退行性疾病发生发展密切相关,但至今为止对αB-晶体蛋白在朊病毒病发生发展中可能扮演的角色研究甚少,作用尚不清楚。本研究利用羊瘙痒因子仓鼠敏感株263K感染仓鼠建立的朊病毒实验动物模型,通过免疫印迹(Western blots)和免疫组织化学染色观察到伴随PrPSc在感染终末期动物脑组织中大量沉积,αB-晶体蛋白表达显著上调,比正常对照增高3倍。免疫荧光双染确定其分布的主要细胞类型为星形胶质细胞,神经元中未检测到表达。感染动物中高表达的αB-晶体蛋白与异常沉积的PrPSc无明显共定位。此研究为进一步探讨和揭示αB-晶体蛋白在朊病毒病中可能的作用和分子机制奠定了基础。     

单克隆抗体有望用于治疗朊蛋白病

朊蛋白病是一组致命的神经系统变性疾病 ,其特征之一是正常的细胞朊蛋白 (PrPC)转变为有感染性的疾病相关蛋白PrPSc。目前朊蛋白病尚无有效的治疗方法。最近White等的研究表明 :抗朊蛋白单克隆抗体ICSM 18能抑制朊病毒复制 ,延缓朊蛋白病的发展。动物实验表明 ,持续进行这种被动免疫治疗的小鼠健康生长长达 5 0 0天以上 ,且未出现自身免疫反应的副作用 ;而对照组未接受单克隆抗体治疗小鼠的平均存活期仅为 197天左右。该研究表明 ,ICSM 18几乎不与PrPSc结合 ,而与PrPC 有高亲和力 ,其抑制作用呈剂量依赖性。它通过识别PrP的抗原决…     

蛋白质错误折叠循环扩增及其在朊病毒蛋白检测中的应用研究进展

朊病毒蛋白（prion protein,PrP）是传染性海绵状脑病的病原体,其检测是该病诊断的重要依据。该文从原理、方法、影响因素和检测应用方面对蛋白质错误折叠循环扩增（protein mis-folding cyclic amplification,PMCA）这种朊病毒蛋白新型检测技术做了介绍,旨在为朊病毒蛋白的检测和发病机制研究提供理论参考。     

朊病毒疾病

朊病毒是一种蛋白性质的感染颗粒,它能引起动物的一类大脑功能紊乱疾病:可传染海绵样脑病(TSE)。本文就朊病毒、朊病毒引起的疾病、牛海绵样脑病(BSE)及BSE能否传给人类进行一些讨论。     

朊病毒感染中钙调蛋白相关激酶含量异常变化的研究

朊病毒病是一类具有致死性、传染性和进行性的神经退行性疾病。目前研究发现许多因子都参与了疾病的发生发展过程,包括细胞因子、激酶和一些离子,其中钙离子及相关激酶在朊病毒病致病机制中的研究报道较少,为了探究朊病毒感染中钙调蛋白相关下游激酶的含量变化情况,本研究利用多种检测方法对朊病毒感染细胞系及小鼠脑组织进行了分析。结果显示朊病毒感染后,钙离子和钙调蛋白(CaM)的表达水平升高,下游Ca²⁺/CaM复合物依赖性激酶CaMKIα和CaMKIV表达水平下降,同时这些激酶的上游激酶CaMKKα含量降低,提示朊病毒感染后神经元中钙离子和相关激酶稳态失衡,这种异常变化很可能影响下游多种转录因子合成,这些结果为解释朊病毒感染后神经元大量丢失提供了科学依据。     

羊瘙痒病小鼠适应株139A可突破种属屏障颅内感染金黄地鼠

羊瘙痒病感染因子可以根据疾病发生的潜伏期、临床病程、神经病理学特征以及PrPSc分子特征等分为不同的毒株,目前已经证实有20余种.在可传播性海绵状脑病的发病过程中存在着明显的种属屏障作用.将小鼠适应株139A颅内接种至金黄地鼠,以观测感染因子对种属屏障的突破及感染特征.在接种385～405天后,感染动物出现明显症状,与以往报道的金黄地鼠适应株263K不同,139A毒株发病动物出现严重的瘙痒,而无明显的共济失调.感染动物自出现明显症状到死亡的时间明显长于263K毒株感染金黄地鼠.进一步脑组织电镜和Western blot检测证实,存在有羊瘙痒病相关纤维和PrP-res.这证明小鼠适应株139A可突破种属屏障感染金黄地鼠.经系统比较,139A和263K毒株在潜伏期、主要临床症状和临床病程显示出明显的差异,而PrP-res的泳动位置和糖基化比率差异不大,仅139A毒株的单糖基化分子位置似乎略高于263K.动态观测处于潜伏期的接种动物脑组织羊瘙痒病相关纤维和PrP-res,发现PrPSc的出现明显早于临床症状.     

羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达和分布变化研究

为了探讨羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中星形胶质细胞和神经元的数量及功能改变,利用免疫印迹、免疫组化方法研究了胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)在受染仓鼠各脑区中表达变化的特点,同时比较其与神经病理学改变及PrPSc沉积的关系.结果表明,感染终末期仓鼠的脑组织中GFAP表达量明显增高,与正常对照相比,大脑皮质、脑干和小脑区域GFAP着色细胞数量分别增高3.69、2.41和1.56倍.感染仓鼠脑组织NSE表达量低于正常对照,小脑、海马CA1区和大脑皮质NSE着色细胞数量分别仅为正常对照相应区域的22.5%、54.2%和53.9%.这些变化与PrPSc在脑组织中的沉积程度和空泡样变性程度相吻合.结果提示,GFAP和NSE的检测可分别很好地反映星形胶质细胞和神经元的数量及功能状态,成为在朊病毒病发病过程中重要的病理变化指标.     

微管相关蛋白tau与朊蛋白的相互作用

微管相关蛋白tau参与了许多神经退行性疾病的发生, 其中包括一些人类可传播性海绵状脑病. 为了探讨tau与朊蛋白(PrP)之间可能存在的关系, 首先通过GST pull-down和免疫共沉淀等技术发现重组tau蛋白可通过微管结合区与来源于正常叙利亚仓鼠脑组织中的正常细胞膜朊蛋白(PrP^C)和羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织的异常朊蛋白(PrPSc)相结合. 利用免疫共沉淀实验发现在正常和羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中存在tau蛋白与PrPC和PrPSc的相互作用, 并且利用激光共聚焦方法检测到PrP和tau蛋白在CHO细胞内具有共定位的关系. 为了确定PrP与tau蛋白相互作用的部位, 构建了不同区域的PrP片段, 从而证明PrP与tau蛋白相互作用的区域位于PrP的N端序列(23~91 aa). PrP与tau蛋白分子间相互作用的直接实验证据提示tau蛋白可能参与PrP的正常生理功能以及朊病毒病的病理过程.     

羊瘙痒病263K毒株感染的仓鼠脑中PrP分子形式多样性的动态测定

正常细胞的朊蛋白(PrPC)代谢和构象的改变是引发动物和人类可传播性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)的根本原因。将羊瘙痒病(scrapie)仓鼠适应株263K颅内接种仓鼠,在接种后的第20、40、50、60、70、80天,通过Westernblot动态检测仓鼠脑中PrP存在的形式。结果在接种后第40天,在感染动物脑组织中即检测到PrPSc分子,比临床症状出现的时间早(平均潜伏期为66 7±1 1天),且无糖基化形式的PrP分子所占百分比在接种后期增加明显。除了标准分子量大小(30kD～35kD)的PrP分子外,在感染动物脑中存在着高分子量和低分子量形式的PrP分子。定量分析显示,随着接种潜伏期的延长,不同形式PrP分子的含量也在增加,其中低分子量形式的PrP分子与临床症状的出现密切相关。蛋白去糖基化实验表明,在感染动物脑组织中,除了标准分子量大小的PrP蛋白外,还存在一条更小分子量的PrP条带,而正常动物脑组织仅存在标准大小的PrP分子。低分子量形式的PrP分子具有与全长PrP分子相类似的糖基化模式。结果提示,scrapie263K感染的仓鼠脑组织中存在不同分子形式的PrPSc,其PrP分子的代谢可能不同于正常动物。     

朊病毒感染对细胞中三羧酸循环关键催化酶的影响研究

为了研究朊病毒感染对细胞氧化供能的主要途径—三羧酸循环关键催化酶的影响。使用ATP检测试剂盒检测朊病毒感染后细胞的ATP表达情况,采用蛋白免疫印迹方法检测朊病毒感染细胞中三羧酸循环关键催化酶的表达情况;使用细胞免疫荧光对催化酶进行细胞定位;应用线粒体分离试剂盒分离线粒体,检测线粒体中催化酶的表达情况。结果显示朊病毒感染后的细胞ATP表达水平明显降低,进一步检测三羧酸循环过程中三个主要的催化酶,发现这三个催化酶在朊病毒感染的细胞中表达量明显降低,免疫荧光实验显示催化酶与线粒体标志蛋白具有空间共定位现象,并发现在朊病毒感染细胞的线粒体中这三个催化酶的表达也显著降低。本研究发现朊病毒感染细胞中三羧酸循环催化酶的表达量明显降低,导致ATP产能下降,影响细胞代谢水平。     

定量研究石斛醇提取物对酵母朊病毒的治愈作用

为研究石斛醇提取物的抗朊病毒作用,借助酵母朊病毒[PSI+]表型系统分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]表型的作用,引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术在蛋白质水平分析石斛醇提取物对酵母朊病毒的治疗效果。结果显示,石斛醇提取物浓度在15 g/L时,作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5 d的治愈率为5%;并且石斛醇提取物浓度在5~20 g/L范围内时,药物剂量与酵母朊病毒[PSI+]表型治疗效果呈现较好正相关性。蛋白水平试验表明石斛醇提取物作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5 d后红色菌落的朊病毒聚集体大小与[psi-]相似。     

新开发的朊病毒蛋白测定法

马萨诸塞州技术研究所和美国国际变态反应和传染病研究所的研究人员开发了朊病毒蛋白的无细胞测定法;这种蛋白是牛海绵状脑疾病和绵羊及山羊疯痒病的感染动因。这种测定法使研究人员能够研究正常脑蛋白PrP~c向感染性朊病毒蛋白PrP~(sc)的转变。 由于需要超过PrP~c50倍以上的PrP~(sc),使上述新系统受到限制。因此难以检测出少量新产生的朊病毒。但是,这种测定法仍是前景乐观的。如果成分中的一种能被固定,或能用其它途径降低所需PrP~(sc)的量,则这种测定法将成为了解朊病毒病致病机制的关键所在。 刚刚在酵母中发现了朊病毒样系统。长期以来,研究酵母遗传学的研究人员对两种蛋白[URE3]和     

鼠诺如病毒感染RAW264.7细胞中干扰素和干扰素激活基因转录水平研究

诺如病毒(Norovirus,NoV)是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原。鼠诺如病毒(Murine norovirus,MNV)是研究诺如病毒的理想研究模型。本研究通过实时定量荧光PCR检测急性感染毒株MNV-CW1和持续性感染毒株MNV-SH1603感染Balb/c小鼠后的排毒情况以及感染RAW264.7细胞后不同时间点病毒RNA扩增、干扰素(Interferon,IFN)和干扰素激活基因(Interferon-stimulated gene,ISG)转录水平,以探讨不同的MNV毒株感染诱导IFNs和ISGs基因表达的特征。研究显示MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染Balb/c小鼠后排毒时间不同。MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染RAW264.7细胞后,6h后出现明显扩增,48h达到病毒复制高峰,随后复制速度减慢。MNV-SH1603增殖比MNV-CW1快。两种病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54转录水平。MNV-CW1感染后,诱导IFN-β,IFN-λ2和ISG15基因表达上调,而ISG54在感染24h后转录水平下降。MNV-SH1603感染初期IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54基因转录水平持续增高,感染24h后IFN-β和ISG54的转录水平明显降低,IFN-λ2和ISG15转录水平峰值在感染后72h。研究揭示MNV病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN和ISG基因表达,但是MNV-CW1和MNV-SH1603诱导的基因表达特征有异同。     

酵母朊病毒的遗传与增殖

１９８２年,Ｐｒｕｓｉｎｅｒ等发现,在感染瘙痒病的仓鼠脑中有一种异常蛋白,名其为“蛋白质感染颗粒”（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｐａｒｔｉ－ｃｌｅ）。Ｐｒｕｓｉｎｅｒ用ｐｒｉｏｎ（现译为朊病毒）这一名词把这类病原体与病毒、细菌、真菌以及其它已知的病原体区分开。后来发现这种蛋白质能够自我催化复制,且有两种构象,即正常态的ＰｒＰＣ和感染态的ＰｒＰＳＣ。两者的化学性质也不同：ＰｒＰＣ能溶于非变性洗涤剂而ＰｒＰＳＣ不溶;ＰｒＰＣ易被蛋白酶消化而ＰｒＰＳＣ则具部分抗性。在酵母中,朊病毒不…     

芍药苷对巨细胞病毒感染小鼠脑组织损伤及海马神经元细胞凋亡的影响

海马组织在学习、记忆中发挥着重要作用,而且海马组织对巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)感染非常敏感,会使海马组织中的神经元大量丢失,神经元细胞发生凋亡.芍药苷可以减轻小鼠炎性脑损伤,其可能与提高机体抗氧化能力、清除体内自由基有关,但是芍药苷在CMV感染小鼠中研究甚少.为探讨芍药苷对CMV感染小鼠脑组织损伤及海马神经元细胞凋亡的影响,本研究将新生昆明小鼠随机分为4组:对照组、小鼠巨细胞病毒组(MCMV组)、芍药苷低剂量组(Pae-L组)和芍药苷高剂量组(Pae-H组),后三组通过腹腔注射MCMV病毒悬液建立模型,之后对照组和MCMV组经腹腔注射生理盐水,Pae-L组经腹腔注射10 mg/kg芍药苷,Pae-H组经腹腔注射30 mg/kg芍药苷;荧光定量PCR检测各组小鼠脑组织中MCMV-DNA载量的变化;Morris水迷宫检测各组小鼠学习记忆功能指标的变化;蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测各组小鼠脑组织中MMP-9的表达变化;NeuN免疫染色检测各组小鼠海马组织中NeuN阳性细胞的变化;TUNEL染色检测各组小鼠海马组织中神经元细胞凋亡的变化;Western Blot检测各组小鼠海马组织中Bax、Bcl-2蛋白表达的变化.结果显示,与对照组比较,MCMV组小鼠的逃避潜伏期明显增加,穿越平台次数明显减少,脑组织中MMP-9蛋白表达水平显著上调,海马组织中NeuN阳性细胞数目显著减少,海马组织中神经元细胞凋亡指数显著增加,海马组织中Bax蛋白表达水平显著上调,Bcl-2蛋白表达水平显著下调;与MCMV组比较,Pae-L组和Pae-H组小鼠脑组织中MCMV-DNA载量减少,逃避潜伏期减少,穿越平台次数增加,脑组织中MMP-9蛋白表达水平下调,海马组织中NeuN阳性细胞数目增加,海马组织中神经元细胞凋亡指数减少,海马组织中Bax蛋白表达水平下调,Bcl-2蛋白表达水平明显上调.本研究提示,芍药苷能够改善MCMV感染引起的脑损伤,减轻海马组织中神经元细胞的凋亡.