RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。     

特异性干扰ICP27基因的siRNA对HSV-1病毒复制的影响

针对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)的ICP27基因和其他疱疹病毒相关基因的高度保守区设计小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),研究其抑制病毒复制的效果。首先构建相应的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),然后通过病毒滴度测定、real-time PCR和细胞致病变效应(cytopathic effect,CPE)检测所设计的siRNA抑制病毒复制的能力。结果显示,所设计的shRNA-2(靶序列起始位置815)和shRNA-3(靶序列起始位置1 367)具有明显地抑制病毒复制的效果。尤其是shRNA-3,抑制病毒复制的效果更明显,在病毒滴度实验中,与阴性对照相比,其抑制倍数为81,同时可以下调ICP27基因的mR NA表达水平。实验结果表明shRNA-3能够显著抑制HSV-1病毒复制的能力,可以作为HSV-1感染性疾病的补充治疗手段,其对应的靶序列可以作为抗HSV-1新的靶标。     

中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2的密码子优化表达及其免疫原性研究

利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性。通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(GenBank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒pET-28a-optiVP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将表达蛋白纯化并免疫至白来杭母鸡,对免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行检测,研究CSBV VP2蛋白的免疫原性。同时,收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化再与CSBV相互作用后,接种于3日龄蜜蜂幼虫,观察接种后幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力。结果显示,优化后的optiVP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有良好免疫原性,表达产物接种白来杭母鸡可诱导产生抗体,制备的卵黄抗体具有中和CSBV的作用。本实验实现了CSBV结构基因VP2在原核系统的高效表达,鸡免疫实验表明其具有良好免疫原性,并且可诱导鸡产生保护作用中和抗体,为进一步开发防治CSBV的生物制剂提供了帮助。     

RNA依赖的RNA聚合酶的结构特征及其靶向抑制剂的开发

新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染导致的急性呼吸道传染性疾病。自2019年爆发以来，SARS-CoV-2在世界范围内引起大流行，严重威胁人类的生命安全。目前，已有的疫苗尚不能提供完全的机体免疫保护。因此，开发广谱有效的抗病毒抑制剂是当下热门的研究方向。SARS-CoV-2属于RNA病毒，其RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)在不同RNA病毒中具有高度保守性，是抗病毒抑制剂研发的重要靶标。RdRp是RNA病毒复制的核心组成部分，具有典型的右手杯状结构特征。本文重点介绍近年爆发并持续流行的新型冠状病毒RdRp的结构特征，以及靶向抑制剂的研发进展。同时，选取了其它几种有代表性的致病RNA病毒：流感病毒、轮状病毒、人类鼻病毒、丙型肝炎病毒和寨卡病毒，介绍了它们RdRp的结构特征及其靶向抑制剂的开发。本研究比较了抑制剂靶点结构的异同及抑制效果差异，并分析了可能导致该差异的原因。最后，本文总结讨论了目前针对RdRp...     

利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)基因的非抗冻功能进行验证,将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA,纯化后注射黄粉虫幼虫,通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA,命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后,Tmafps的表达受到显著抑制,相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。     

小菜蛾抑制性谷氨酸受体的RNA干扰

谷氨酸门控的氯离子通道（glutamate-gated chloride channels, GluCls）或抑制性谷氨酸受体（inhibitory glutamate receptor, IGluR）是阿维菌素类药剂（avermectins）主要的作用靶标, 目前人们对于昆虫的IGluR知之甚少。本实验采用RNA干扰（RNAi）技术对小菜蛾Plutella xylostella IGluR的功能进行了初步研究。结果表明： 小菜蛾2龄和3龄幼虫中双链RNA（dsRNA）的最佳注射量分别为50.6 nL和71.3 nL。实时荧光定量（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测结果表明, 2龄和3龄幼虫在注射dsRNA 36 h和24 h后IGluR基因的转录后水平分别下降了32.67%和49.30%。幼虫发生RNA干扰后对阿维菌素的敏感性结果显示, 注射了IGluR dsRNA的幼虫死亡率显著低于对照。结果说明, 小菜蛾IGluR是阿维菌素的潜在靶标之一, 为进一步阐明小菜蛾对阿维菌素靶标抗性机理奠定了基础。     

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型,严重制约了HCV复制,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的研究.对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp.NS5B C端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性.在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制,特别是能有效复制HCV全长(+)RNA.高浓度GTP激活HCV RdRp活性.NS5B N/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性,但D区345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高.HCV RdRp的发现及其功能研究为HCV药物研究提供了新型靶标.     

RNA干扰MDCht9基因的家蝇幼虫的转录组分析

家蝇(Musca domestica)属于双翅目昆虫,广泛分布于世界各地,目前家蝇抗药现象较为严重.为了筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,本研究以家蝇幼虫为实验对象,采用RNAi方法沉默家蝇几丁质酶MDCht9基因后,分析幼虫mRNA转录组表达变化,初步探讨MDCht9的功能.研究结果表明,在注射dsRNA 24 h后,幼虫MDCht9 mRNA的表达显著下降85％,提示干扰有一定效果.实验组与对照组相比共筛选出378个基因差异表达显著,其中上调基因162个,下调基因216个,占所有被检测到转录RNA基因的百分比为2.66％.通过GO和KEGG相关生物信息学分析,挖掘出涉及幼虫时期生长发育、蛋白质的消化与吸收、雄虫性成熟、物质代谢等相关通路基因.采用实时荧光定量PCR对差异基因进行验证,与转录组结果一致.本实验通过RNAi方法成功降低MDCht9基因mRNA表达,MDCht9基因参与幼虫时期生长发育、蛋白质的消化与吸收、雄虫性成熟、物质代谢等功能.本研究结果有助于后续生物信息学分析及为家蝇生长发育关键基因的挖掘提供基础数据,为害虫防治提供新的靶标途径.     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp,NS5B蛋白).以HCV正、负链RNA 3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成.结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性.NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响.这样,就合理解释了在HCV RNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题.同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础.     

RNA干扰作用(RNAi)研究进展

RNA干扰作用 (RNAi)是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象 ,是基因转录后沉默作用 (PTGS)的重要机制之一 .RNAi主要通过dsRNA被核酸酶切割成 2 1～ 2 5nt的干扰性小RNA即siRNA ,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现 .RNAi要有多种蛋白因子以及ATP参与 ,而且具有生物催化反应特征 .RNAi是新发现的一种通过dsRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径 ,在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中具有广阔应用前景     

LncRNA13164通过ace-miR-4968-y调节中华蜜蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答

【目的】长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)等多种方式发挥重要的调控作用,但蜜蜂lncRNA的功能研究至今依然缺失,lncRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫响应蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染的免疫应答中lncRNA的调控功能及作用机制。笔者团队前期通过深度测序和生物信息学分析发现,lncRNA13164与ace-miR-4968存在靶向关系且潜在参与在中蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的应答。【方法】利用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测蜜蜂球囊菌接种后中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达谱。采用ILoc-Lnc RNA软件预测lncRNA13164的亚细胞定位。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测lnc...     

RNA干涉在纤毛虫中的研究进展

RNA干涉是dsRNA介导的基因沉默现象,本文简要介绍了其作用的机制和生物学意义,重点阐述了RNA干涉在原生动物纤毛虫中的发现与应用,比较了RNA干涉与纤毛虫大核基因组重排机理的异同,并对RNA干涉在纤毛虫中传输的技术途径-RNAi喂饲法的原理也做了详细的介绍。     

Suppression of RNA interference pathway <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis> by Grass carp reovirus

The means of survival of genomic dsRNA of reoviruses from dsRNA-triggered and Dicer-initiated RNAi pathway remains to be defined.The present study aimed to investigate the effect of Grass carp reovirus...