基于磁珠富集法开发并筛选西川红景天的微卫星标记

利用FIASCO磁珠富集法,开发和筛选青藏高原特有珍贵植物西川红景天(Rhodiola alsia)多态性微卫星标记。结果表明:用(AG)15和(AC)15两种微卫星标记探针构建富集文库,共获得阳性克隆约2500个;从中随机挑取1200检测,发现具有多态性的阳性克隆达400个;随机挑取200多态性的阳性克隆进行测序,从中获得105个SSR位点,用在线软件primer3-2.3.4成功设计得SSR引物105对;其中45对可以成功扩增,而13对所扩增的片段在相距较远的4个自然居群的24个个体中显示较高的遗传多态性。用4个居群的80个个体检测这13对引物发现,平均等位基因数(A)约为9.192,观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)均值分别约为0.712和0.734,如此高的多态性已经满足后期研究的需要;数个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡(P0.01),这可能是实际研究的居群并不能达到哈迪—温伯格定律所假设的无限大等理想状态所致。结合此前基于表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)序列开发的SSR多态性位点,该研究结果为今后利用SSR位点开展西川红景天的居群遗传结构分析和其他研究提供了一组有效工具。     

磁珠富集法分离刀鲚微卫星标记

利用磁珠富集法分离微卫星序列,以开发长江刀鲚微卫星分子标记。将长江刀鲚基因组DNA经限制内切酶Mse I酶切,回收400-1 000 bp片段,安装接头,构建长江刀鲚全基因组PCR文库。用生物素标记的微卫星探针(CA)12与其杂交,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。将洗脱所得片段进行PCR扩增,然后进行克隆。经过菌落PCR检验后挑选出118个阳性克隆进行测序,其中97条含有微卫星序列。用设计合成59对微卫星引物对30尾养殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选,得到9对多态性引物。     

Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针与大熊猫基因组酶切片段杂交,捕获400—600bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pGEM-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。应用γ^32P标记的探针筛选文库,从2880个转化子中获得了260个阳性克隆。对54个序列进行了测序,并成功地设计了大熊猫微卫星引物37对。该方法能有效提高筛选微卫星标记的效率。     

三叶木通微卫星分子标记开发及评价

为了获得适于三叶木通遗传多样性和遗传结构研究的微卫星分子标记,该研究采用磁珠富集法构建了三叶木通微卫星富集文库。结果表明:在150个阳性克隆中发现了70个微卫星位点,富集效率为46.67%,其中含双碱基重复单元的序列占比为79.37%,三碱基和四碱基重复含有量较少。共设计引物63对,其中筛选出16对高多态引物,对1个三叶木通自然居群48个个体进行了遗传分析,结果显示位点的等位基因数为10~22个,观察杂合度和期望杂合度分别为0.370~0.792和0.724~0.936,多态性信息指数为0.725~0.919,表明以上引物均为高多态性引物。其中,12个位点偏离哈迪-温伯格平衡,呈现出纯合子过剩状态,这可能与哑等位基因和其它因素有关。综上结果表明,该研究所开发的16对引物能够用于三叶木通遗传多样性和遗传结构评价工作。     

鲮微卫星DNA分子标记的筛选与遗传多样性分析

采用磁珠富集法对已建立的生长较快的西江段野生浅色鲮群体的极大、极小群体各31尾基因组DNA进行了微卫星序列的筛选,128个阳性克隆成功测序93个,其中80个为的微卫星序列,微卫星序列完美型占85%,非完美型占6.25%,混合型占8.75%。利用微卫星序列合成了23对微卫星引物,扩增结果表明,等位基因数为1～10个,扩增片段大小为92～283bp,其中14对引物扩增条带清晰,为中度或高度多态位点,极大、极小群体的平均有效等位基因数和平均多态信息含量分别为3.0784、3.2079和0.5675、0.5974,反映出2个群体遗传多样性均较丰富;高度多态性引物4的位点b,片段大小为119bp,在极大群体中出现频率为61.3%,在极小群体占22.6%,出现频率极大群体高于极小群体近3倍,初步可作为候选差异性分子标记。     

磁珠富集法筛选实验豚鼠微卫星分子标记

目的直接从实验豚鼠基因组DNA中筛选获得微卫星分子标记。方法应用磁珠和生物素标记的微卫星探针与豚鼠基因组酶切片段杂交,捕获200～1000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD-18V载体中,转化到感受态细胞E.coli DH5α中构建富集微卫星序列的小片段插入文库。然后用PCR法进行筛选。结果从约2000个转化子中获得240个阳性克隆。对其中98个进行了测序,并成功设计豚鼠微卫星引物17对。结论经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得豚鼠微卫星标记。本研究获得的微卫星位点将成为豚鼠遗传学研究的有力工具。     

青鱼野生与养殖群体遗传变异的微卫星分析

研究利用自主开发的12个微卫星标记, 对来自于长江水系4个野生群体(湖北石首、湖南湘江、江苏邗江、浙江嘉兴)和1个养殖群体(江苏吴江)青鱼(Mylopharyngodon piceus)进行遗传多样性和遗传结构分析。遗传多样性分析结果显示这12个位点多态信息含量(PIC)介于0.660—0.923, 表明这12个位点均具有高度多态性(PIC>0.5)。5个群体的平均等位基因数(N_a)介于7.917—11.667, 平均有效等位基因数(N_e)介于4.837—6.035; 平均观测杂合度介于0.713—0.861; 平均期望杂合度介于0.749—0.819; 平均多态信息含量介于0.711—0.788, 表明这5个群体均具有较高的遗传多样性。遗传距离分析结果表明4个野生群体之间遗传距离较近, 养殖群体与这4个野生群体遗传距离均较远。UPGMA系统进化树显示, 湘江群体和石首群体首先聚为一支, 然后与邗江群体和嘉兴群体聚为一支, 最后与吴江养殖群体聚为一支。这12个微卫星位点具有较为丰富的遗传多样性特征, 可以用于青鱼不同群体的种质资源的评估和遗传多样性的分析。     

文蛤微卫星DNA的筛选及其特性分析

采用磁珠富集分离法从文蛤(Meretrix meretrix)的基因组中筛选得到49条微卫星DNA序列,其中两碱基重复有3种类型36个序列,四碱基重复有14种类型26个序列.重复次数在5～30之间的序列占75.6%,30次以上重复的序列占24.4%,最高重复次数为100.根据重复单元的排列特点,完美型、非完美型及混合型序列所占比例分别为61.2%、14.5%和24.5%.本研究中构建的文蛤微卫星文库将在文蛤种质资源评价及分子遗传学研究中发挥作用.     

中国特有单种属血水草的微卫星分子标记开发与评价

血水草(Eomecon chionantha Hance)是中国亚热带地区特有的单种属植物。本研究采用(AG)15、(AC)15两种生物素探针及磁珠富集法从血水草基因组中开发并筛选出13个微卫星位点,且在该物种中能进行稳定的PCR扩增并表现出多态性。利用筛选出的13个SSR多态性标记对血水草4个野生居群24个个体进行PCR扩增,结果显示每个微卫星位点的等位基因数为2~7个,观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)分别为0.125~0.792和0.299~0.691。说明这些SSR标记可用于血水草遗传多样性的后续研究,并揭示该物种地理分布格局形成的原因,有助于保护和利用中国亚热带地区的血水草野生资源。     

火红熊蜂微卫星标记的筛选及种特异性分析

火红熊蜂Bombus pyrosoma是中国特有的熊蜂资源, 在华北地区分布十分丰富, 是众多野生植物和农作物的重要传粉者。为了探究火红熊蜂的遗传结构及其进化关系, 首次开展了该种熊蜂卫星标记的筛选及其种特异性研究。本研究采用生物素-磁珠吸附分离法从火红熊蜂基因组中筛选微卫星标记, 并选取黑熊蜂亚属Melanobombus其他7种熊蜂进行了这些标记的种特异性验证。结果表明： 不同探针与磁珠杂交产生的微卫星标记阳性克隆率存在很大差异, TC探针的微卫星阳性克隆率最高为82%; TG探针次之, 为28%; AT和GC探针分离未获得微卫星标记克隆。根据获得的阳性克隆的序列设计引物进行筛选验证, 共获得31对熊蜂微卫星序列特异性引物。微卫星标记分析发现, 完美型(perfect)18个, 占58.1%; 非完美型(imperfect)10个, 占32.3%; 混合完美型(compound perfect)1个, 占3.2%; 混合非完美型(compound imperfect)2个, 占6.4%。不同探针的微卫星核心序列重复数不同, TC探针和TG探针的微卫星核心序列最高重复数分别为28和15个, 最低重复数分别为7和11个。利用所获得的31对微卫星引物对黑熊蜂亚属其他7种熊蜂进行检测, 有26对引物可以扩增所测试的7种熊蜂, 其他5对引物只能扩增部分熊蜂种类, 其中BPM5是火红熊蜂种特异性引物。本研究从火红熊蜂基因组中筛选的微卫星标记, 不仅可用于火红熊蜂的遗传结构、 分子进化和资源保护等方面的研究, 而且可进一步用于黑熊蜂亚属其他种群的遗传特性分析。     

长江中下游黄鳝遗传多样性的微卫星分析

为了解我国长江中下游地区野生黄鳝(Monopterus albus)的种质资源现状,利用黄鳝微卫星分子标记分析我国长江中下游4个黄鳝野生群体(湖北群体、安徽群体、江苏群体和浙江群体)的遗传多样性水平.通过磁珠富集法获得50个黄鳝徽卫星序列,设计并合成了30对微卫星引物,经筛选得到8对多态性稳定的引物,均为高度多态位点.每对引物扩增得到等位基因数12 -26,平均等位基因数17.4个群体的平均多态信息含量分别为0.804、0.864、0.824和0.736,平均等位基因数分别为9.13、11.00、9.00和7.25,平均期望杂合度分别为0.865、0.918、0.882和0.813,表明4个黄鳝群体遗传多样性丰富,其中安徽群体遗传多样性水平最高,浙江群体相对较低.4个群体间遗传分化指数(FsT)为0.031 2-0.096 5,6.28％的遗传变异存在于群体间,表明4个群体间存在一定的遗传分化.聚类分析显示,浙江群体与安徽群体先聚在一起,再与江苏群体聚为一支,湖北群体单独聚为一支.     

The effects of meal size on postprandial metabolic response and post-exercise metabolic recovery process in juvenile black carp (Mylopharyngodon piceus)

The effects of meal size on the postprandial metabolic response and of digestion on the post-exercise metabolic recovery process were investigated in juvenile black carp (Mylopharyngodon piceus) . Experimental fish were forcedly fed with compound feed (meal sizes: 0.5%, 1% and 2% body weight). Then, the postprandial oxygen consumption rate and excess post-exercise oxygen consumption (EPOC) of the experimental fish were measured. Both the duration and the peak of oxygen consumption rate (PMR) increased with increasing meal size. The peak post-exercise metabolic rate of digesting fish were significantly higher, whereas EPOC magnitude and its duration were significantly smaller or (shorter) than those in the fasting fish. It is suggested that (1) this fish fulfills the increased energy demand during the digestive process by increasing PMR and by prolonging SDA duration with increasing meal size and (2) digesting fish might decrease their anaerobic exhaustive activity but increase the post-exercise recovery capacity.     

青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。     

青鱼生长激素cNDA的克隆与序列分析

从青鱼（Mylopharyngodon piceus）脑下垂体中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增出青鱼生长激素cDNA编码区,克隆到Pucm-T载体上。序列测定表明青鱼生长激素基因的开放阅读框架含有630bp,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,青鱼生长激素基因的克隆成功为该基因的功能及应用研究奠定了基础。     

锦鲤4个人工雌核发育家系的微卫星标记研究

利用Crooijmans et al.(1997)分离的包含CA重复单元的普通鲤鱼（Cyprinus carpio L.)的8个微卫星DNA标记,对从锦鲤（Cyprinus carpio L.)的红白,大正和昭和3个不同品系中所获得的4个不同人工雌核发育家系的20尾个体进行PCR扩增。电泳结果表明,8对引物在20尾个体中均能重复稳定地扩增出相应的同源序列。随引物不同,各等位基因数为1－11个,大小在68－264bp。在MFW4,MFW7,MFW19,MFW20,MFW23和MFW24 6个微卫星的扩增结果中,20尾个体的扩增图谱呈现了高度的遗传多态性,不同雌核发育家系内个体的遗传异质性也较大。其中大正（TaS)和红白1（RW1）的个体不仅花色分化显著,而且个体间的平均遗传距离分别高达0．28。通过对微卫星等位基因和基因型分析发现,由于锦鲤品系中的每一个体是通过不断地杂交选育而获得,基因组来源复杂,基因高度杂合。因此,只进行1代的人工雌核发育,其家系内仅部分个体的部分座位出现纯合。所获得的人工雌核发育锦鲤为后续的色素遗传调控机制研究提供了必要的实验材料;同时,所鉴定的微卫星分子标记为进行锦鲤的分子标记育种的基因组作图提供了理想的工具。     

青鱼逃逸过程中的疾冲-滑行游泳行为

本实验以青鱼（Mylopharyngodon piceus）为研究对象,定性分析了通过电击实验鱼受到惊吓而产生的快速逃逸游泳行为,并定量分析了其疾冲游泳过程中加速度、最大疾冲游泳加速度和减速过程中的加速度。在自然光照下,保持实验水温为（20.0±1.0）℃。青鱼的3种不同体长规格分别为稚鱼（9.21±1.89）cm（n=30）、幼鱼（17.83±2.67）cm（n=30）和亚成体（61.45±0.80）cm（n=10）。实验过程中发现实验鱼逃逸游泳行为主要以疾冲-滑行的游泳方式进行,即实验鱼到达最大疾冲速度后身体保持固定直线不变的形式减速。3种实验体长的青鱼,其对应的最大绝对逃逸速度分别为（1.261±0.279）m/s、（1.542±0.280）m/s和（2.292±0.567）m/s,到达最大逃逸速度的时间分别为（0.249±0.089）s、（0.293±0.067）s和(0.216±0.024) s,对应的最大相对逃逸速度（实验鱼每秒内游泳距离相对于体长的倍数）分别为（13.694±3.032）BL/s、（8.648±1.571）BL/s和（3.729±0.923）BL/s。单因素方差分析表明,实验鱼的绝对疾冲速度随体长的增加而增加,亚成体的最大疾冲游泳速度显著大于稚鱼（P<0.05）;相对疾冲速度随体长的增加而减小,3种实验鱼之间的最大相对疾冲游泳速度均存在显著性差异（P<0.05）;亚成体的绝对滑行游泳加速度的绝对值显著高于幼鱼和稚鱼(P<0.05）。3种实验鱼之间的相对滑行加速度不存在显著性差异（P>0.05）。     

中国特有种爆杖花的微卫星分子标记开发与评价

爆杖花（Rhododendron spinuliferum）是中国西南地区特有的观赏和药用植物。为了研究爆杖花和碎米花之间的杂交物种形成过程,本研究利用FIASCO方法对爆杖花进行微卫星引物开发,从100对引物中筛选出28个微卫星标记,其中22个为多态。利用爆杖花两个居群共24个个体对22个多态性位点进行分析,结果显示：每个位点具有2~5个等位基因,平均为34个,其观测杂合度和期望杂合度分别为0083~0792和0153~0744。对筛出的28个微卫星标记在碎米花的两个自然居群中也做了检测,结果显示：有22个微卫星标记成功扩增,其中20个有多态性;每个多态位点有2~6个等位基因,平均为32个,其观测杂合度和期望杂合度分别为0000~0833和0117~0736。开发的微卫星标记可用于爆杖花及其近缘物种的居群遗传学分析和杂交物种形成研究。     

鲤鱼微卫星分子标记的筛选

微卫星 (ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ)是近十几年来发展起来的一种新的分子标记 ,它是指以少数几个核苷酸 ( 1～ 6个 )为单位多次重复的简单序列 ,以双核苷酸重复最为常见 ,而其中又以 (ＣＡ/ＧＴ) ｎ 居多。由于微卫星在真核生物基因组中是随机分布的 ,而作为分子遗传标记又有着非常高的多态性和共显性 ,因此在构建遗传连锁图谱时备受青睐 (Ｂｒｏｏｋｅｔａｌ ,1994 )。目前 ,在人类和多种动物中已经构建了以微卫星为主的遗传连锁图谱。但在鲤鱼等水产动物的遗传连锁图谱中 ,微卫星分子标记还较少 (孙效文和梁利群 ,2 0 0 0 )。为了摸索…     

饲料中添加中性蛋白酶对青鱼生长、消化及鱼体组成的影响

用含中性蛋白酶8000U/g的酶制剂,制作酶制剂使用量分别为0‰、0.5‰、1‰、2‰和3‰的5种实验饲料,喂养平均初始重为(3.03±0.04)g的5组三重复的青鱼鱼种8周。实验在容积为80L的15只循环式水族箱中进行。实验水温为(25.0±0.5)℃。结果表明：实验饲料中酶制剂含量为0.5‰时,实验鱼的鱼体增重与摄食不含酶制剂饲料的实验组无显著差异(P>0.05), 而当饲料中酶制剂含量提高至1‰时,鱼体增重出现显著提高(P<0.05)。但饲料中酶制剂含量从1‰进一步提高至2‰和3‰,则鱼体增重不再有显著变化(P>0.05);饲料中酶制剂含量为1‰、2‰和3‰实验组的摄食量显著高于饲料中酶制剂含量为0和0.5‰的实验组(P<0.05)。而饲料中酶制剂含量为1‰、2‰和3‰实验组的饲料系数显著低于饲料中酶制剂含量为0和0.5‰的实验组(P<0.05);青鱼饲料中使用酶制剂对饲料干物质的表观消化率、实验鱼的肠蛋白酶活性、肠和肝胰脏淀粉酶活性、全鱼营养组成、脏体指数、肝体指数无显著影响(P>0.05);饲料中0.5‰－3‰酶制剂含量时,实验鱼对饲料蛋白质的表观消化率均显著高于饲料中不含酶制剂的实验组 (P<0.05)。青鱼鱼种肝胰脏蛋白酶活性随着饲料中酶制剂使用量从0增加0.5‰和1‰而呈逐渐升高的趋势,但饲料中酶制剂使用量继续增加则不再有显著变化。因此,在本实验条件下,饲料中使用1‰－3‰的中性蛋白酶制剂促进青鱼鱼种的生长和降低饲料系数。