山羊β—酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子Ⅸ（human clotting factor Ⅸ,hFⅨ)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子1、内含子1、外显孔子2共约6.7kb片段以及hFLX全长cDNA序列和部分经改造的内含子1的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠（9♂,3♀）,整合率为11.2%,经ELISA和Western blot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFⅨ的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%,FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合小鼠的不同染色体上,结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFⅨ基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFⅨ的生物活性。     

不同方向内含子对重组CHO细胞中神经生长因子表达的影响

为了研究不同方向的嵌合体内含子对重组神经生长因子 (Nerve growth factor,NGF) 基因表达的影响,以人β-珠蛋白第一内含子5?端剪接序列和人免疫球蛋白重链可变区内含子3?端剪接序列组合而成的嵌合体内含子作为研究对象,在NGF基因5?端插入不同方向的嵌合体内含子,构建含不同方向内含子的NGF基因表达载体。转染至CHO细胞后,G418筛选稳定转染的细胞,荧光定量PCR、ELISA和Western blotting检测不同载体NGF基因的表达情况。结果显示内含子可以大幅度提高NGF基因的表达,且正向内含子对NGF基因表达的增强作用无论是在mRNA水平还是在蛋白水平都要高于反向内含子。所以内含子能够提高外源NGF基因的表达,且内含子调控转基因表达具有方向性。     

蚊浓核病毒介导的人工内含子在蚊体内外的初步应用

根据人β-球蛋白基因第一内含子5′-端供位序列与免疫球蛋白重链可变区基因3′-端受位序列构建人工内含子,将人工内含子插入重组蚊浓核病毒质粒载体p7NS1-GFP中GFP融合表达的病毒非结构蛋白NS1的编码框内,构建成载体p7NS1-Intron-GFP,与辅助载体pUCA共转染蚊C6/36细胞系,荧光显微镜下观察细胞内GFP的表达情况。纯化、回收共转染后形成重组病毒与野生病毒,共感染白纹伊蚊二龄幼虫并观察幼虫体内GFP的表达情况。结果在C6/36细胞与蚊幼虫体内均观察到GFP的高效表达,证实人工内含子无论在蚊细胞系内还是在活体幼虫内均可正常行使其自我剪切的功能,未影响到下游蛋白GFP的表达。本研究为人工内含子在蚊虫细胞内的应用奠定基础,为蚊虫及其病原体相关基因工程技术提供新的策略。     

牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控

构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平 3倍以上     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

以HIV-1为骨架的慢病毒载体在其假病毒的转录本中保留其内含子不被剪切

通过在FUGW中克隆入各外源基因表达盒,如红系特异表达人β珠蛋白(HBG),或山羊乳腺特异表达人血清白蛋白(pBLG-ALB)等,研究以HIV-1为骨架的慢病毒载体FUGW在其假病毒的转录本中内含子的剪切情况.将慢病毒载体制备成假病毒后抽提其病毒RNA,通过逆转录和PCR验证其内含子剪切保留情况;同时,在相对应的慢病毒假病毒介导的转基因小鼠中也进行类似的PCR验证.在制备假病毒的转录过程中,其外源基因所携带的內含子在病毒所包含的基因组RNA中被部分保护不被剪切,且优先保护5′端的内含子.此现象正好与野生型HIV-1的保护顺序相反.     

内含子的位置不影响转基因的表达

内含子在转基因动物的基因表达中具有重要作用,以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因５′区为调控序列,人基因组Ｇ－ＣＳＦ基因为目的片段,将ＷＡＰ基因第一内含子插入Ｇ－ＣＳＦ基因５′端,构建成转基因动物乳腺表达载体。将其直接注射到小鼠乳腺,在泌乳期表达出人Ｇ－ＣＳＦ。表明内含子在５′端的位置不影响转基因的表达,同时也表明内含子对表达有一定的作用。     

嵌合内含子对抗bFGF抗体基因在293T细胞中表达的影响

目的：构建含嵌合内含子和抗bFGF抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中表达,探讨嵌合内含子对抗体表达的影响。方法：设计引物分别从载体pCl-neo和pComb3-Fab25中扩增出内含子和抗体Fd段、κ链基因序列,按不同组合构建到含人免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段基因的表达载体pIgG中。重组质粒经脂质体PEI转染293T细胞,荧光显微镜观察质粒转染情况,采用夹心ELISA和Western blot检测细胞上清中抗体的表达。结果：DNA测序和酶切分析表明,内含子和抗体基因成功插入pIgG,获得了重组质粒pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron。倒置荧光显微镜下可观察EGFP大量表达,Western blot分析上清中有抗体的表达,夹心ELISA检测pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron抗体表达量分别为1.21mg/L、0.468mg/L、7.39mg/L、0.601mg/L。结论：成功构建了含嵌合内含子和抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中得到表达。嵌合内含子插入κ链基因5’端可提高抗体的表达,插入Fd段5’端则抑制抗体的表达。     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒双价RNA沉默抗病载体的快速构建*

利用重组PCR技术将烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因（△MP）和黄瓜花叶病毒（CMV）部分复制酶基因（△Rep）连接起来,获得全长约1000 bp的MP-Rep融合基因,将所得融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游,构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBIN438-MP-Rep（i/r）。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致。该研究结果为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础。     

微小腺病毒载体介导的人凝血IX因子小基因的离体表达

将带有内源内含子的人凝血ＩＸ因子ｃＤＮＡ（ｈＦＩＸ小基因）构建到不含腺病毒基因而只带有反向末端重复顺序（ＩＴＲ）和包装信号ψ等顺式元件的微小腺病毒（ｍｉｎｉ－ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）载体ＧＴ２０７３上,得到载体ＧＴｉ’ＩＸ。将该载体与带有ｌａｃＺ报告基因的微小腺病毒载体ｐＲＰ１００１分别转移４入腺病毒馐细胞２９３Ｃｒｅ４中,随后专杂辅助病毒ＡｄＬＣ８,从而馐出微小腺病毒ＡｄＧＴｉ’ＩＸ和ＡｄＲＰ１０     

Nodal基因的第一内含子中存在着顺式调控增强子元件

小鼠ｎｏｄａｌ基因是在胚胎发育时期表达的一个基因,它在原肠期起着重要作用,并且参与左－右体轴的决定,４１３－ｄ小鼠胚胎干细胞系３５６３在ｎｏｄａｌ基因的第一内含子中含有单拷贝逆转录病毒的插入。采用定量ＲＮａｓｅ保护法比较了该细胞系及其母源ＥＳ细胞ＣＣＥ中ｎｏｄａｌ基因的表达量,ＣＣＥ细胞中ｎｏｄａｌ ｍＲＮＡ的含量是３５６３ＥＳ细胞含量的２．３倍。这一结果提示原病毒在ｎｏｄａｌ基因第一内含子中的整     

鸡β-肌动蛋白第一内含子对EIAV转移载体外源蛋白表达能力的影响

以马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）基因转移载体pcPPTWPRE为基础,用含不同长度片段的鸡β-肌动蛋白启动子替换原有的人巨细胞病毒立即早期启动子（CMVIEp）启动外源基因的表达,分别构建了2个基因转移载体,含部分第一内含子的pWCAGP0.8和含全长内含子的pWCAGP1.6。连同在其它研究中构建的不含内含子的质粒pcPPTWCAG（另文发表）,采用磷酸钙法分别转染HEK293细胞和DF-1细胞, 利用荧光显微镜观察报告基因eGFP蛋白的表达。并利用流式细胞仪定量。统计学分析结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8和 pWCAGP1.6表达阳性率分别为47.9%、46.1%和23.8%,转染后48h,收获细胞,利用流式细胞仪比较转染细胞中EGFP表达阳性细胞的百分率。结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8 和pWCAGP1.6的阳性细胞分别占计数细胞的47.9%、46.1%和23.8%;在DF-1细胞中,依次分别为12.4%、9.5%和4.2%,pcPPTWCAG与pWCAGP1.6差异显著。本研究表明不含内含子的EIAV载体质粒表达EGFP的能力高于含部分和全长内含子的载体。     

不同方向内含子对重组CHO细胞中神经生长因子表达的影响（英文）

为了研究不同方向的嵌合体内含子对重组神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)基因表达的影响,以人β-珠蛋白第一内含子5'端剪接序列和人免疫球蛋白重链可变区内含子3'端剪接序列组合而成的嵌合体内含子作为研究对象,在NGF基因5'端插入不同方向的嵌合体内含子,构建含不同方向内含子的NGF基因表达载体。转染至CHO细胞后,G418筛选稳定转染的细胞,荧光定量PCR、ELISA和Western blotting检测不同载体NGF基因的表达情况。结果显示内含子可以大幅度提高NGF基因的表达,且正向内含子对NGF基因表达的增强作用无论是在mRNA水平还是在蛋白水平都要高于反向内含子。所以内含子能够提高外源NGF基因的表达,且内含子调控转基因表达具有方向性。     

猪胰岛素启动子调控EGFP表达载体的优化及体外验证

目的获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础。方法利用猪胰岛素启动子（PIP,包含5＇调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5 kb）构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-Hind IIIEGFP。鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化：将Hind III酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3＇端的内含子剪接受体位点（splicing acceptor site,SA）突变为Hind III内切酶识别位点,命名为PIP-SA（M）-EGFP。三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48 h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Western blot检测,验证载体的表达效率。结果转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光。RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异：载体PIP-Hind III-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA（M）-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Western blot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高。结论通过突变胰岛素启动子第一内含子的3＇端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪。     

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视.本研究以pCAMBIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体.通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用.组织化学检测结果表明:CaMV35S启动子调控下的iGUS (带内含子)基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子(带内含子)调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子(带内含子)驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生.Ubi1启动子(带内含子)调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用.本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义.     

腺病毒介导的含第一内含子pGH cDNA在CHO细胞中的表达

通过同源重组的方法分别构建了在CMV启动子控制下的带有第一内含子和不带内含子的pGH cDNA基因的重组腺病毒。通过感染CHO细胞表明,构建的重组腺病毒能够介导pGH基因在CHO细胞中表达,加入第一内含子的pGH cDNA基因的表达效率比不加内含子的提高了117％,这说明pGH基因的第一内含子有促进该基因在真核细胞中表达的功能。     

负链不分节段RNA病毒反向遗传系统中通用型真核表达载体的构建

本研究选择pVAX1作为供体载体,通过分子克隆方法,分别用人工合成的锤头型核酶、丁型肝炎核酶序列(用于获得转录后病毒基因组RNA的精确末端)和含有9个常用限制性酶切位点的linker序列(用于病毒基因组插入的多克隆酶切位点)取代真核表达载体pVAX1的多克隆酶切位点,将其改造成负链不分节段RNA病毒反向遗传系统的通用型表达载体。通过酶切鉴定和序列测定表明,pVAX1载体中插入的核酶及linker序列正确无误,并将CTN株狂犬病病毒全长基因组cDNA插入pVAX-R中,通过与辅助质粒的共转染成功拯救CTN株狂犬病毒,证明通用型真核表达载体构建成功,为快速建立负链不分节段RNA病毒反向遗传系统奠定基础。     

狗凝血Ⅸ因子cDNA的克隆及其离体表达研究

根据cFⅨcDNA(canineFⅨ ,cFⅨ )顺序设计引物 ,采用RT PCR技术 ,从狗肝细胞中提取mRNA ,逆转录成cFⅨcDNA ,克隆到pGEM T质粒载体上 ,经DNA顺序分析 ,挑选克隆 ,拼接并测序鉴定 ,得到DNA顺序完全正确且含有cFⅨ完整编码区的cDNA ,进一步构建成以G1Na为框架的反转录病毒载体G1NaCcⅨ (hCMV启动子控制cFⅨ转录 )和G1NaMBcⅨ (MCK增强子和β actin启动子共同控制cFⅨ转录 ) ,并用于反转录病毒介导的基因转移 .狗原代皮肤成纤维细胞实验结果显示 ,cFⅨ能够在狗皮肤成纤维细胞中表达 ,表达水平分别为G1NaCcⅨ :173ng/ 10 6 细胞·2 4h ;G1NaMBcⅨ :2 11ng/ 10 6 细胞·2 4h .此结果为血友病B狗基因治疗动物试验的开展奠定了基础 .     

人乳头瘤病毒6b型H增强子样序列在大肠杆菌中增强基因转录和β-干扰素表达

将人乳头瘤病毒６ｂ型（ＨＰＶ６ｂ）基因组上游调控区（ＵＲＲ）５４０ｂｐ的Ｓａｕ３Ａ－ＮａｒＩ片段（Ｈ序列）,正反向插入β－干扰素表达载体Ｔｒｐ启动子上游,使β－ＩＦＮ表达明显增强,可使基因表达水平提高３．６倍（正向）和２．１倍（反向）。Ｈ序列正反向插入增强子检测载体不仅使β－半乳糖苷酶表达活性增加５－１０倍,还能使半乳糖苷酶ｍＲＮＡ量明显增高,证明Ｈ序列对被调控基因的增强作用是发生在转录水平。