利用PCR-RFLP技术对鲫鱼6个不同品系的鉴定

采用PCR-RFLP方法分析鲫鱼不同品系mtDNA ND3/ND4L/ND4基因片段,对野鲫、异育银鲫、红鲫、白鲫、彩鲫及金鱼的基因片段进行测序,测序结果用RESearch-version1.0软件对限制性内切酶特异性位点进行分析,最终选择MvaⅠ核酸限制性内切酶对目的基因片段进行酶切,同时引入鲤鱼作为外类群,构建了系统树.酶切结果分析表明,基于聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析能快速而准确地区分鲫鱼的4个不同品系,首次提出异育银鲫和浙江地区野鲫(河鲫鱼)在mtDNAND3/ND4L/ND4基因上的分子鉴定法,为物种鉴定提供了一定的理论研究基础.但野鲫、金鱼、彩鲫的基因序列两两只有一个碱基的差异,相似度接近100％,用酶切软件(RESearch-version1.0)进行分析后未能找到区别三者的限制性内切酶位点,这一结果也验证了关于金鱼、彩鲫起源于野鲫的观点.     

洞庭青鲫与其他六个鲫鱼品系线粒体DNA控制区的比较分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,在获得洞庭青鲫和彭泽鲫线粒体DNA控制区全序列的基础上,对洞庭青鲫、彭泽鲫、普通鲫、红鲫、白鲫、A系和D系银鲫等7个鲫鱼品系线粒体DNA控制区的碱基组成、变异情况、序列结构和系统进化进行了比较分析。结果表明,7个鲫鱼品系线粒体DNA控制区碱基的平均组成为A:(32.7±0.16)%,C:(20.4±0.37)%,G:(14.1±0.08)%,T:(32.8±0.36)%,序列分歧率为0—5.7%,其中红鲫和白鲫的分歧率最大(5.7%),彭泽鲫、A系和D系银鲫之间最小(0)。洞庭青鲫与白鲫的分歧率为5.6%,与彭泽鲫、A系和D系银鲫为2.2%,与红鲫和普通鲫分别为0.8%和0.7%。对比哺乳动物线粒体DNA控制区结构,并参照其他鱼类序列,将7个鲫鱼品系的控制区分为终止序列区、中央保守区和保守序列区三个区域。同时识别了7个鲫鱼品系中一系列保守序列,并给出了它们的一般形式。序列差异和系统进化分析表明,在7个鲫鱼品系中,洞庭青鲫与普通鲫和红鲫的亲缘关系最近,与彭泽鲫、A系和D系银鲫亲缘关系次之,与白鲫的亲缘关系最远,而彭泽鲫、A系和D系银鲫三者在线粒体DNA控制区的相似性和分歧率上则表现为是同一个鲫鱼品系。       

鲫鱼遗传多样性的初步研究

用１７种限制性内切酶对鲫属普通鲫鱼低背型,高背型,异育银鲫,日本白鲫及华南鲤的变种红鲤共１２４个个体的线粒体ＤＮＡ进行了ＲＦＬＰ分析,１４种酶具多态,共计４３种限制性态型,１１种单倍型。     

三个鲫品系DNA含量的比较研究

采用流式细胞术 (FCM)对红鲫、彭泽鲫、异育银鲫进行红血球DNA含量的检测分析比较 ,以鉴定它们的倍性。结果显示 ,红鲫红血球的DNA含量是 3 0pg ,彭泽鲫是 4 7pg ,异育银鲫是 4 8pg。显而易见 ,彭泽鲫的DNA含量是二倍体红鲫的 1 57倍 ,异育银鲫的DNA含量是红鲫的 1 6倍。采用肾细胞直接制作染色体的方法进行红鲫、彭泽鲫、异育银鲫的染色体倍性鉴定 ,结果红鲫的染色体数目是 10 0 ,为二倍体 (2n =10 0 ) ,彭泽鲫的染色体数目是 162 ,为三倍体 (3n =162 ) ,异育银鲫的染色体数目是 156— 162 ,为三倍体 (3n =156— 162 )。研究证明 :不同品系鲫的DNA含量高低与染色体的倍性有显著的正相关性     

鲤鱼,鲫鱼和鲤鲫移核鱼DNA的复性动力学研究与比较

才文报道鲤鱼、鲫鱼DNA复性动力学研究结果。它们均由快、中、慢速复性3个组份构成。鲤鱼DNA中Cot<1×10(-1)的复性组份占7.5％,1×10(-1)1×10~2的复性组份占75％;鲫鱼DNA中Cot<5×10~(-1)的复性组份占22％;5×10~(-1)1×10~2的复性组份占70％。它们都没有明显百分数的迥折序列组份;快速复性组份的拷贝数低于10~6,相当于中度重复序列1;中、慢速复性组份则分别为中度重复序列Ⅱ和原拷贝序列。在快速复性部份,鲤鱼与鲫鱼之间表现出较大差异。此外,本文还就鲤鱼和鲫鱼的DNA复性动力学与鲤鲫移核鱼(cyc(?))F_3进行了比较。鲤鲫移核鱼DNA的复性动力学特征与其细胞核供体鱼(即鲤鱼)是相似的。这说明异源细胞核与胞质的结合没有导致核内DNA基因组结构出现明显变化。     

四个鲫鱼品系线粒体DNA的限制性酶切分析

用差速离心和核酸酶消化法从红鲫 (C auratusredvar .)、湘鲫 [F1hybridsofredcruciancarp (♀ )×commoncarp (♂ ) ]、野鲫 (C auratusauratus)和白鲫 (C auratuscuvieri)的肝组织及白鲫的卵巢中提取和纯化线粒体DNA。用 9种内切酶 (EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和KpnⅠ )进行单酶酶解 ,经琼脂糖凝胶电泳分析 ,检测出PstⅠ、KpnⅠ和BglⅡ 3种酶在品系间存在限制性片段长度多态性 ,但并未检测出品系内的限制性片段长度多态性。计算出红鲫、湘鲫、白鲫和野鲫的mtDNA大小分别约为 16 19、 16 0 2、 16 6 0和 16 0 6kb。根据限制性酶切片段共享度 ,计算出 4个品系间的遗传距离 ,结果表明存在直接亲缘关系的红鲫与湘鲫之间的遗传差异最小 ,证实了红鲫与子代湘鲫之间mtDNA遵循母系遗传的特性。     

鲫不同种系线粒体DNA物理图谱的构建

用１３种限制性内切酶对鲫鱼三个亚种共七个品系的线粒体ＤＮＡ进行分析,其中有９种酶在种系间或种系内产生限制性片断长度多态性,发现了１６个线粒体ＤＮＡ组合单倍型,通过双酶切分析,构建了１６个线粒体ＤＮＡ组合单倍型的１３种限制性内切酶的发点的物理图谱。     

猕猴属五个种mtDNA多态性研究

本文以10种限制性内切酶研究猕猴属5个种(Macaca mulatta.M.nemestrina.M.assemensis.M.thibetana,M arctoides)线粒体DNA进化。在13个个体中,共检出8种限制性类型。恒河猴种内存在广泛的线粒休DNA限制性片段长度多态性(RFLP)。结合日本猴(M.fuscata)的有关资料,构建了猕猴属6个种的分子系统树,并给出各个种的分化时间。结果表明,这6个种可分成4个类群,熊猴和藏酋猴、恒河猴和日本猴之间的遗传距离较近,可分别划为同一类群,红面猴与其他5种猴的遗传距离最远,在系统发生上分离最早。     

三倍体湘云鲫线粒体DNA序列变异性分析

对26尾三倍体湘云鲫的线粒体tRNA-Thr基因、tRNA-Pro基因和部分控制区的核苷酸序列进行了测定,获得26条长度为837—839 bp的同源基因序列,共发现65个多态性核苷酸变异位点,多态位点比例为0.077,定义了8种单元型。在湘云鲫8种单元型中确认了DNA复制终止相关的序列TAS、中央保守区序列(CSB-F、CSB-E和CSB-D)和保守序列CSB1,8种单元型含有3—5个TAS序列。在65个变异位点中,大部分序列变异为转换,8种单元型之间的序列差异在0.1%—6.3%之间。该研究为三倍体湘云鲫的繁殖和遗传改良提供了一些有价值的信息。     

条纹斑竹鲨线粒体DNA的研究

用6种限制性内切酶分析了4条条纹斑竹鲨的线粒体DNA(mtDNA)。PstⅠ、Hpa Ⅰ、XbaⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、BglⅡ在条纹斑竹鲨mtDNA分子上分别具有0至2个切点, mtDNA分子大小为16.6kb,根据单酶和双酶完全酶解片段的大小,构建了条纹斑竹鲨mtDNA 的限制性酶切图谱。 Abstract:Mitochondrial DNA(mtDNA)form 4 samples of Chiloscyllium plagiosum was analyzed by 6 kinds of restriction.The number of cleavage sites were as follow:2 for HpaI,XbaI and EcoRI respectively;1 for BglII and EcoRV respectively;None for PstI.Molecular size of mtDNA was found to be 16.6kb.According to analysis of single and double enzyme cleavage,the map of restriction enzyme was constructed.     

云南高背鲫鱼不同组织同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了滇池中云南高背鲫鱼(Carassius auratus)的脑、眼睛、肝脏、心脏、肌肉5种组织中的酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)3种同工酶的表达模式,并对各种酶的同工酶酶谱表型进行了分析。结果表明,云南高背鲫鱼的同工酶系统具有明显的组织特异性,且同工酶的种类与活性变化与其功能相适应。     

Fine-structural study of leucocytes in the goldfish, Carassius auratus

An electron microscopic study was performed on leucocytes from circulating blood of the goldfish. The leucocytes were divided into eight types: neutrophil, eosinophil, large granular leucocyte (LGL), medium-sized granular leucocyte (MGL), small granular leucocyte (SGL), fine granular leucocyte (FGL), lymphocyte, and monocyte. In this report the thrombocyte was excluded from leucocytes, and LGL, MGL, SGL and FGL were tentatively classified based on the size of intracytoplasmic granules possessed by each cell. The existence of goldfish monocytes was electron microscopically demonstrated for the first time in the present report.     

盐酸沙拉沙星在鲫体内的残留及消除规律研究

采用高效液相色谱法测定鲫组织中沙拉沙星并初步研究了盐酸沙拉沙星在鲫组织中的残留及消除规律。在21±2℃下,以20mg/kg的剂量单次口灌给药,取血浆和肌肉、皮肤、肝胰脏、肾脏、卵巢5种组织,各样品中加入甲磺酸达氟沙星作内标,用二氯甲烷提取组织中的药物,正己烷去脂,反相高效液相色谱法测定其中盐酸沙拉沙星的浓度。此方法平均回收率均大于82.97%,日间变异系数小于8.41%,最低检测限可达0.0125μg/g。研究结果表明盐酸沙拉沙星在血浆和5种组织中消除速率快慢不一,肾脏为盐酸沙拉沙星残留的靶组织。若规定可食用组织中的盐酸沙拉沙星在最大残留限量为30μg/kg,由休药期(WDT)公式可得出盐酸沙拉沙星在鲫体内的WDT为14d。       

鲫鱼微卫星DNA的分离及多态性分析

目的：用近缘物种鲤微卫星引物来分离鲫鱼微卫星标记并对其多态性进行分析。方法：以鲫鱼基因组DNA为模板,采用6对鲤微卫星引物进行PCR扩增,PCR产物经8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色检测。结果：筛选出2个以AC和TA为重复单元的鲫鱼新的微卫星标记。多态性分析表明,这2个微卫星标记的遗传杂合度分别为0.611和0.644,多态信息含量为0.536和0.572,属于高度多态性标记。结论：该研究筛选的2个微卫星标记可应用于鲫鱼遗传多样性、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种等方面的研究。     

天然三倍体鲫鱼突变体萍乡肉红鲫线粒体细胞色素b基因序列分析

用细胞色素b(Cyt b)基因特异性引物,对萍乡肉红鲫(Carassius auratus var.pingxiangnensis)的线粒体Cyl b基因进行PCR扩增和双向测序.在12个个体中均得到序列一致的Cyt b基因全序列,长度为1 140 bp.其A、T、G、C含量分别为28.2%(321)、28.8%(328)、14.8%(170)和28.2%(321),A+T含量(57%)明显高于G+C含量(43%).与其他水生动物相同基因片段碱基含量相似.该基因中密码子第1位核苷酸中4种碱基组成较为均衡;第2位核苷酸中T的使用率较高,为41.8%,G的使用率较低,为13.2%;密码子第3位A的使用率较高,为39.7%,而G的使用率较低,仅为6.3%.BLAST结果显示,萍乡肉红鲫与其他鲫鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性,其中与银鲫(C.a.gibelio)的相似性为93%,与普通鲫鱼(C.carassius)的相似性为98%.邻接法构建的分子系统进化树表明,萍乡肉红鲫与普通鲫鱼亲缘关系最近.     

鲫源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

【目的】探明上海某养殖场的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)发生死亡的病因,研究致病菌分类地位和毒力基因携带情况。【方法】通过病原菌的筛查和回感试验,确定发病原因,对16S rRNA基因、gyrB和rpoB管家基因测序,建立病原菌系统进化树,结合API-32E细菌鉴定系统对菌株的生理生化进行鉴定,综合判定致病菌的种类及其分类地位;根据已报道的7个毒力基因fimA、citC、gadB、mukF、katB、esrB和sodB序列,设计引物进行PCR扩增,研究病原菌毒力基因携带情况。【结果】致病菌GY15是导致异育银鲫发病的原因,GY15的16S rRNA、gyrB和rpoB基因与已报道的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)相似性在99%以上,构建系统进化树和API鉴定确定该菌株为E.tarda,腹腔注射回感可导致异育银鲫死亡,半致死浓度(LD_(50))为4.26×105 CFU/m L;已报道的7种毒力基因在该致病菌中均能被检测到;药敏试验结果显示,该菌对恩诺沙星、氟苯尼考和氧氟沙星等15种药物敏感,对新霉素、四环素和复方新诺明等18种药物表现为耐药。【结论】首次报道E.tarda可感染异育银鲫,它对异育银鲫的养殖造成威胁。     

鲫鱼血清和皮肤粘液IgM的分离纯化及部分性质的鉴定

采用盐析法结合葡聚糖凝胶柱 ,分离纯化鲫鱼血清IgM ;然后制备兔抗鲫鱼血清IgM多克隆抗体 ,将其偶联到Sepharose 4B上制成亲和柱 ,用于分离纯化皮肤粘液IgM。结果表明 :33%～ 4 5 %硫酸铵溶液沉淀处理可以去除鲫鱼血清中除IgM外的很多杂蛋白 ,再经葡聚糖凝胶柱纯化 ,IgM纯度可达 80 %以上 ,其重链和轻链的分子量分别为 79和 2 5kDa ;以兔抗鲫鱼血清IgM多克隆抗体亲和柱分离皮肤粘液IgM ,分离效果良好 ,IgM重链的分子量为 88kDa ;Westernblot显示兔抗鲫鱼血清IgM多克隆抗体识别的是血清和皮肤粘液IgM的重链部分。用ELISA测定鲫鱼血清中IgM含量在一年中的变化 ,结果表明IgM在春夏季的含量高于秋冬季     

苯酚和对苯二酚对鲫血细胞DNA损伤的研究

酚类可通过水产动物皮肤、鳃吸入或摄入肠道引起肌肉异味;挥发酚对鱼类有一定的急性毒性1 ,这必然会引起人们对食品安全的担忧。