枯草芽孢杆菌B-903菌株的诱变选育*

枯草芽孢杆菌B-903菌株是由河南省农业科学院植物保护研究所从郑州果园中分离得到,其代谢产生的抗菌物质对多种植物病原真菌具有较强抑制作用。以此菌株为出发菌株,进行亚硝基胍(NTG)和微波诱变处理,确定了二者诱变处理的最佳处理剂量:NTG最佳处理浓度为200μg/mL,微波诱变为HI微波挡(850W、脉冲频率2450MHz)处理100s,筛选出13个高效突变株。经传代实验,2株高效突变株N₁和W₂抑菌圈直径分别稳定在26mm和24mm以上,比出发菌株提高21·8%     

枯草芽孢杆菌纤溶酶基因在转基因烟草组织中的分泌表达

克隆枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillussubtilisfibrinolyticenzyme,BSFE)基因及其前导肽序列。通过农杆菌EHA105介导转化,获得转基因烟草植株。其BSFE的表达水平为叶片42.97±28.59U·g-1FW、茎15.14±10.57U·g-1FW和根25.55±14.71U·g-1FW。其内源BSFE信号肽可在转基因烟草中行使蛋白转运功能,使BSFE具有分泌表达特性。这一系统可用于建立利用植物组织分泌表达外源蛋白的系统模型。     

枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶固体发酵条件的优化*

芽孢杆菌是产甘露聚糖酶的优良菌株,首次研究芽孢杆菌固体发酵条件的优化。以天然麸皮作为基本原料,研究利用枯草芽孢杆菌WY34固体发酵生产β-甘露聚糖酶的发酵条件。最佳固体发酵培养条件为:麸皮5 g,初始水分含量71%,初始pH 7.0,接种量为2 mL,1%Tween-80,0.4 g魔芋粉,培养温度50℃。在最适条件下培养5 d,甘露聚糖酶酶活高达7,650 U/g干基,是未优化前酶活的2.78倍。     

高溶纤酶活性枯草芽孢杆菌的分离筛选与鉴定

从多个枯草样品中分离纯化得到 2 0株芽孢杆菌 ,并进行了鉴定。通过对固体发酵所产生的溶纤酶的研究 ,发现均能不同程度地产生溶纤酶 ,其中菌株FM-S1、FM-S2、FM-S8、FM-S6、FM-S11产生的溶纤酶活性均高于日本的纳豆杆菌。同时对筛选的菌株的形态和菌落形态、生理生化特性进行鉴定 ,确认所筛选到产酶菌株均属于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。另外 ,对FM S2作固体发酵确定在熟大豆上枯草杆菌溶纤酶生物合成的模式为同步合成型。     

枯草芽孢杆菌BS-26菌株纤溶酶的性质分析及活性组分的分离纯化

[目的]溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段,从微生物中寻找溶栓药物是一种理想有效的途径,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-26菌株发酵液具有很强的体外纤溶活性,本文分析了发酵液中纤溶酶的性质并对活性组分进行了分离纯化.[方法]利用纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性,利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰胺制备电泳等方法,进行分离纯化.[结果]此菌株产生的纤溶酶在50℃以下和pH5.0～11.0范围内具有较好的稳定性,最适作用温度为42℃;最适pH值为9.0;Mg2 、Ca2 对此酶有明显的激活作用,而Cu2 能完全抑制酶的活性;174.2μg/mL的苯甲基磺酰氟、1000μg/mL的鸡卵类粘蛋白和1000μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂能完全抑制酶活性,初步说明此酶属于丝氨酸蛋白酶类;体外溶纤作用表明,该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原.从该菌株的发酵液中获得了一种纤溶酶组分,比活力达8750 U/mg,回收率为3.2%,所获得样品纯度相对于发酵液提高了41倍,该酶在SDS-PAGE中是单肽链蛋白,分子量为32 kDa.[结论]获得了一种纤溶酶的单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化及进一步研制和开发新的溶栓药物提供重要理论依据.     

产纤溶酶枯草杆菌液体发酵工艺优化研究

采用单因子实验和正交实验对高产纤溶酶的枯草杆菌最佳发酵工艺进行了优化,结果表明,该菌株分泌的胞外酶具有较强的体外溶栓作用,产纤溶酶最佳的发酵条件为：3％可溶性淀粉,2％豆浆全汁(鲜豆),0．02％CaCl2,培养温度为37℃,初始pH8．3,装液量为250mL三角瓶50mL,发酵时间44h左右,Ca^2 、Mg^2 和Mn^2 对酶活力有促进作用,Cu^2 对酶活性有强烈抑制作用。     

生长因子对枯草芽孢杆菌纤溶酶在转基因烟草根系中分泌表达的调节

根系可分泌表达枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme,BSFE)的转基因烟草在0、8、16和24h的光照条件下,在25℃、30℃和昼30℃／夜25℃、16h／8h光暗培养条件下和通气与不通气的水培处理下,其水培液BSFE活性呈抛物线型变化趋势。延长光照时间可加快其根系向水培液中分泌BSFE,峰值出现提前,但培养后期水培液BSFE活性急剧降低。四个时间处理相比,8、16h光照处理能维持该转基因烟草根系BSFE分泌的较高水平。建议生产中使用16h以上光照培养．适当缩短培养液更新周期,以8～10d为宜。昼30℃／夜25℃培养条件下水培液BSFE活性在峰值出现前介于30℃、和25℃培养条件之间,而峰值出现后则高于30℃、和25℃、培养条件,说明温度对器官生长、代谢的影响是造成3种温度处理下水培液BSFE活性差异的主要原因。通气处理可提高该转基因烟草根系BSFE的分泌水平。但在1～15d的培养期内,通气处理与不通气处理间不存在显著差异。这说明通气处理对短时间培养并不必要。     

利用degQ基因提高枯草芽孢杆菌纤溶酶表达*

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中通过PCR扩增得到degQ基因,将其克隆到含有枯草杆菌纤溶酶基因的蔗糖诱导表达载体pUBS中,并转化至B.subtillisDB403受体菌,得到基因工程菌DB403(pUBSD)。通过发酵表达证实degQ基因能增强枯草杆菌纤溶酶的表达,酶活提高了2.2倍。同时还对不同种类的糖、不同浓度蔗糖、不同诱导时间等发酵条件进行优化和比较研究。     

藤黄微球菌纤溶酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

MLFE(Micrococcus luteus fibrinolytic enzyme)是由一株新的纤溶酶产生菌藤黄微球菌ML909分泌的胞外纤溶酶。从一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DC-4中克隆a-淀粉酶基因的启动子－信号肽序列, 将其与mlfe基因(GenBank, 登录号为EU232121)的成熟肽编码序列相融合, 构建成融和基因amymlfe。将该基因克隆到大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭质粒pSUGV4上, 构建成表达质粒pSU-AmyMLFE, 再将其转化     

地衣芽孢杆菌TS-01固态发酵培养基的优化*

分离到一株饲用地衣芽孢杆菌TS-01 ,初步研究了该菌的固态发酵培养基 ,得到的最优发酵培养基为 (g/kg干固体物料 )含水量 60 0、红糖 7、米糠 42 0、麸皮 5 80。当采用此种配比的培养基 ,接种量为 10%(v/w) ,发酵 2d后 ,菌体浓度可达 9.15×10⁹CFU/g鲜曲 ,芽孢浓度可达 7.50×10⁹CFU/g鲜曲 ,芽孢形成率在 80 %以上。     

嗜热网球菌纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

通过化学方法合成嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)来源的纤维二糖差向异构酶基因ce,将其引入到载体pBSuL3-ce,构建重组质粒pBSuL3-ce并转化进枯草芽孢杆菌,发酵48h后测定胞内酶活为7. 5U/ml。酶学性质结果表明:该酶的最适pH为8. 5;最适温度为85℃,85℃的半衰期为120min。为降低发酵成本,对发酵培养基进行优化:以35g/L豆粕粉为氮源、5g/L甘油为碳源时,酶活力最高可达12. 3U/ml。依据摇瓶优化的条件在3L发酵罐中扩大培养,胞内酶活达到56U/ml,比摇瓶培养酶活提高了8倍。利用发酵所得酶制备乳果糖,在乳糖浓度为400g/L、反应温度为85℃、初始pH 8. 5、加酶量为20U/ml的条件下,乳果糖转化率可达51%。     

嗜麦芽寡养单胞菌(DR-929)纤溶酶的发酵条件优化及其分离纯化

本试验研究了嗜麦芽寡养单胞菌（DR-929）纤溶酶的液体发酵条件及其分离纯化。最佳发酵条件为：可溶性淀粉2.0%,黄豆粉1.0%,酵母膏0.5%,NaCl 1.0%, CaCl2 0.02%,MgSO4 0.05%,种龄36h,发酵时间4d,初始pH 8.0或9.0,温度25℃,装样量30mL,接种量5%或6%。采用发酵液离心除菌,25%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Phenyl FF（high sub）疏水层析,Q-Sepharose FF离子交换层析,Superdex 75凝胶过滤层析对活性成分分离纯化。用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行检验,结果表明在SDS-PAGE中得到单一条带,分子量28.3KD。最终纯化倍数和酶活回收率分别为271.5和24.5%。     

双启动子促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中表达及发酵研究

为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子P_(HpaⅡ)之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(P_(grac)、P_(gl-M1))和4种组成型启动子(P_(43)、P_(laps)、P_(HpaⅡ)、P_(amyQ))进行构建表达,其中组成型启动子P_(amyQ)与P_(HpaⅡ)构成的双启动子效果最好,有效地将胞外活性提高到31. 24U/ml,是单启动子PHpaⅡ的3. 4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽,但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis168/pW6(P_(HpaⅡ)-P_(amyQ))进行7. 5L发酵罐补料发酵产酶研究,LeuDH酶活达到217. 96U/ml,是摇瓶水平的6. 97倍,对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。     

一株纤维蛋白溶解酶产生菌的鉴定及其产酶条件初步研究

从亚洲传统发酵食品--虾酱中筛选到一株产纤维蛋白溶解酶能力较强的菌株,通过形态和常规生理生化性质鉴定,发现该菌株与芽孢杆菌属细菌的特征很相近,结合16S rDNA序列分析,构建系统发育树,确定其分类地位,由中国典型培养物保藏中心定名为Bacillus sp.nov.SK006(CCTCC No.M 205071),并优化了发酵培养基组成及培养条件,本研究为该菌株的深入研究和广泛应用提供了理论依据.     

Rapid production of thermostable cellulase-free xylanase by a strain of Bacillus subtilis and its properties

A Bacillus subtilis strain isolated from a hot-spring was shown to produce xylanolytic enzymes. Their associative/synergistic effect was studied using a culture medium with oat spelts xylan as xylanase inducer. Optimal xylanase production of about 12 U ml⁻¹ was achieved at pH 6.0 and 50°C, within 18 h fermentation. At 50°C, xylanase productivity obtained after 11 h in shake-flasks, 96,000 U l⁻¹ h⁻¹, and in reactor, 104,000 U l⁻¹ h⁻¹ was similar. Increasing temperature to 55°C a higher productivity was obtained in the batch reactor 45,000 U l⁻¹ h⁻¹, compared to shake-flask fermentations, 12,000 U l⁻¹ h⁻¹. Optimal xylanolytic activity was reached at 60°C on phosphate buffer, at pH 6.0. The xylanase is thermostable, presenting full stability at 60°C during 3 h. Further increase in the temperature caused a correspondent decrease in the residual activity. At 90°C, 20% relative activity remains after 14 min. Under optimised fermentation conditions, no cellulolytic activity was detected on the extract. Protein disulphide reducing agents, such as DTT, enhanced xylanolytic activity about 2.5-fold. When is used xylan as substrate, xylanase production decreased as function of time in contrast, with trehalose as carbon source, xylanase production in maintained constant for at least 80 h fermentation.     

一种产生纤溶酶的链霉菌C-3662的鉴定及发酵研究

对一株从土壤中分离的纤溶酶产生菌链霉菌C-3662的形态、培养、生理生化和化学分类特征进行了研究,发现其与泛温链霉菌(Streptomyces eurythermus Corbaz et al. 1968)的特征很相符。通过对链霉菌C-3662的16S rDNA序列进行测定与比对,发现它与泛温链霉菌的16S rDNA序列也有高达98.19%的同源性。根据多相分类原则,认为链霉菌C-3662属于泛温链霉菌。对链霉菌C-3662的发酵培养基组成等的研究表明,合适的发酵培养基中应含有氮源黄豆饼粉2.0%、碳源淀粉1.0%和葡萄糖2.5%以及少量的无机盐类如硫酸镁。链霉菌C3662的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌丝体生长停止之后才大量产生。     

重组枯草杆菌纤溶酶的酶学性质研究

对一种重组枯草杆菌纤溶酶 (rBSFE)的酶学性质进行了初步研究 ,结果表明 :酶作用最适温度为 35℃ ;最适反应pH为 8.0 ;酶活性能被PMSF抑制 ,是典型的丝氨酸蛋白酶。通过与尿激酶进行比较 ,发现该酶对纤维蛋白有直接降解作用 ,而对于纤维蛋白原的敏感性则低于尿激酶 ,提示该酶具有直接溶栓作用 ,又不致引起出血 ,是一种有潜力的新型溶栓剂。     

枯草芽胞杆菌甘露聚糖酶发酵条件优化

旨在以枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis J为生产菌株,发酵生产β-甘露聚糖酶,通过优化产酶条件,以达到提高β-甘露聚糖酶产量的目的。利用DNS比色法检测β-甘露聚糖酶活力,采用单因素试验,研究碳氮源种类及碳氮源浓度、温度、pH、接种量和装液量对菌株Bacillus subtilis J发酵产β-甘露聚糖酶的影响,结合响应面试验设计确定菌株Bacillus subtilis J发酵产甘露聚糖酶的最优发酵培养条件。单因素试验和响应面试验得到最优的发酵条件为魔芋粉28 g/L,胰蛋白胨21 g/L,K₂HPO₄ 6 g/L,MgSO₄·7H₂O 1 g/L,温度31℃,pH值8.5,接种量1%(体积分数),装液量50 mL/250 mL,发酵周期24 h。利用优化后的培养基生产β-甘露聚糖酶,其酶活力达到84.38 U/mL,是初始发酵培养基产酶活力的3.36倍。通过对发酵条件的优化,大幅度提高了β-甘露聚糖酶的产量,为其工业生产提供参考。     

枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白的研究

枯草芽胞杆菌孢子表面展示技术是最近十几年新兴的一种外源蛋白固定方法,已在酶学、疫苗学、靶向药物制备、金属污染治理等领域获得了广泛应用。以孢子衣壳蛋白为载体蛋白,已经成功地把许多抗原、酶和其他蛋白展示在孢子外表面。枯草芽胞杆菌孢子衣壳由多种衣壳蛋白组成,但可用做载体蛋白的并不多,且它们的特性不同。综合介绍了枯草芽胞杆菌孢子表面展示外源蛋白这种新型技术的具体机理,及其在国内外各领域应用的研究进展。