组蛋白去乙酰化酶CfSnt2调控果生刺盘孢生长发育和致病力

炭疽病是油茶Camellia oleifera的重要病害,该病害的优势致病菌是刺盘孢属Colletotrichum的果生刺盘孢C. fructicola,在全国的油茶产区普遍发生。我们前期发现组蛋白乙酰转移酶CfGcn5调控油茶果生刺盘孢的生长发育和致病过程,但组蛋白去乙酰化酶在该病菌中的生物学功能尚不清楚。本研究以组蛋白去乙酰化酶CfSnt2为研究对象,利用反向遗传学的方法,通过对野生型、CfSNT2基因敲除突变体及互补菌株的生物学表型进行比较分析,发现CfSNT2基因敲除突变体的菌丝生长速率明显减缓、分生孢子的产量显著减少、附着胞形成率降低、对细胞壁胁迫剂的响应异常,同时对油茶致病力显著减弱。以上现象说明CfSnt2调控果生刺盘孢的生长、产孢、附着胞的形成、对细胞壁完整性胁迫剂的耐受性及致病力。     

基于Cfku70基因失活策略构建果生刺盘孢的高效基因敲除底盘菌株

果生刺盘孢侵染危害多种植物,是重要的植物病原真菌。在一些丝状真菌中,敲除非同源末端连接修复通路的关键基因ku70或ku80可显著提高同源重组效率,进而提高靶基因置换频率。本研究从果生刺盘孢基因组鉴定到Cfku70和Cfku80两个基因,并明确了基因失活对菌株生物学表型和基因敲除效率的影响。敲除Cfku70或Cfku80不影响菌株的菌落形态、营养生长、产孢、分生孢子萌发、侵染结构发育和致病;Cfku70基因敲除还大幅提升3个测试基因的敲除效率。本研究证实Cfku70基因失活能显著提高果生刺盘孢的基因敲除效率,适宜作为高效基因敲除的底盘菌株,研究结果为通过批量敲除策略筛选新型致病因子奠定重要基础。     

CfNop12参与调控果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要致病菌。研究果生刺盘孢RNA结合蛋白基因CfNOP12的生物学功能,阐述果生刺盘孢致病的分子机制,为油茶炭疽病的防治提供理论基础。根据同源重组原理,在果生刺盘孢中敲除目标基因CfNOP12,PCR验证获得正确的突变体ΔCfnop12;进一步构建PYF11::CfNOP12回补质粒,导入突变体原生质体中,筛选成功互补菌株ΔCfnop12-C。对这些菌株进行生物学表型测定,发现突变体ΔCfnop12营养生长速率显著下降,分生孢子的产量及附着胞形成率显著降低;在含有细胞壁胁迫剂的PDA培养基上,突变体ΔCfnop12的抑制率相较于野生型和回补菌株显著升高,在低温条件下,突变体的生长速率表现出明显下降;野生型和回补菌株几丁质聚集在菌丝顶端,突变体ΔCfnop12尖端几丁质分布不正常;相比于野生型和回补菌株,突变体致病力显著降低。综上所述,潜在RNA结合蛋白基因CfNOP12参与调控了果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力。     

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

bZIP转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长发育和致病力

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要病害之一,引起该病害的主要致病菌为果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola。本研究以果生刺盘孢菌bZIP类转录因子CfHac1为研究对象,研究其在果生刺盘孢菌的营养生长、产孢量、附着胞形成、致病力及耐受性等方面的生物学功能,为油茶炭疽病的防控提供理论依据。研究结果表明,果生刺盘孢菌中具有一个与灰色大角间座壳（稻瘟菌）bZIP转录因子MoHac1直系同源的基因,命名为CfHAC1。该基因全长1 627bp,编码526个氨基酸,该蛋白含有一个碱性亮氨酸链（bZIP）结构域和3个未知功能结构域。CfHAC1基因敲除突变体的菌丝生长速度显著变慢,分生孢子产量显著减少且不能正常形成附着胞,并对山梨糖醇和KCl渗透压胁迫敏感性增加;致病力测试结果表明,果生刺盘孢菌基因敲除突变体ΔCfhac1对油茶的致病力显著下降。转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长、产孢、附着胞的形成、致病力以及响应外界渗透压胁迫过程。     

基于报告基因敲入构建果生刺盘孢细胞核荧光标记菌株

运用基因敲入技术,将GFP、mCherry整合到果生刺盘孢 Colletotrichum fructicola组蛋白histone H1位点,实现融合表达,获得细胞核荧光标记菌株。基于标记菌株可以对分生孢子、营养菌丝、附着胞、侵染菌丝等结构中的细胞核进行实时活体观察。果生刺盘孢存在性亲和的“+”、“-”型菌株分化,GFP“+”型菌株和mCherry“-”型菌株接触形成明显杂交线,杂交线上单子囊内含红绿两种孢子,表明“+”、“-”型菌株间发生杂交;杂交线上子囊壳壁表达mCherry,表明由“-”型菌株发育而来。本研究构建的核荧光标记菌株将是研究果生炭疽菌细胞周期调控和有性繁殖过程的重要材料。     

果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因Cfcyp450的功能

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola能够引起苹果炭疽叶枯病和苹果苦腐病。前期通过基因组分析发现一个叶枯型C. fructicola菌株特异基因Cfcyp450。本研究对其功能进行分析,以明确其在致病中的作用。采用同源重组方法获得了敲除突变体。表型分析显示,Cfcyp450敲除突变体与野生型生长速率无明显差别,但敲除突变体菌落变白;与野生型相比,突变体附着胞形成降低30.02%;侵染钉延伸菌丝对玻璃纸的穿透率下降41.19%。致病性测定显示,突变体对嘎啦叶片致病力显著下降。生物信息学分析显示,Cfcyp450仅存在于叶枯型菌株中,同时与烟草和拟南芥内生菌同源性较高,但与刺盘孢属物种亲缘关系较远。这些结果表明果生刺盘孢Cfcyp450基因为叶枯型菌株的关键致病因子,可能通过水平转移获得。     

组蛋白甲基化与去乙酰化对蛇足石杉内生真菌盘长孢状刺盘孢合成石杉碱甲的影响

以蛇足石杉Huperzia serrata内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01菌株为研究对象,利用PEG介导的同源重组转化体系,对Cg01组蛋白甲基化酶基因（histone methyltransferases,HMT）CgClr4和组蛋白去乙酰化酶基因（histone deacetylase,HDAC）CgClr3、CgSir2进行基因敲除与回补,并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲huperzine A（HupA）产量。结果显示3个基因敲除突变体菌株ΔCgClr4、ΔCgClr3、ΔCgSir2的HupA产量分别为255μg/L、270μg/L、244μg/L,与野生型菌株相比分别下降了21.3%、16.6%、24.7%。在基因回补突变体菌株ΔCgClr4/CgClr4、ΔCgClr3/CgClr3、ΔCgSir2/CgSir2中,相应回补基因表达均与野生型无显著性差异,其HupA产量分别为351.9μg/L、334.7μg/L、331μg/L,回补菌株的HupA产量回复到野生型水平。结果表明这3个基因均具有调控内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01合成HupA的作用,为研究蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲的合成调控机制提供了理论基础和新的思路。     

液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢的生长发育和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要流行致病菌.本文研究果生刺盘孢中液泡分选蛋白CfVps17的生物学功能,为阐明该蛋白调控致病分子机制提供依据.采用over-lap方法构建CfVPS17基因敲除载体片段,使用PEG介导法将敲除载体片段转化至果生刺盘孢原生质体中,通过验证筛选获得突变体菌株△Cfvps17.构建目的 基因CfV...     

油茶果生刺盘孢组蛋白乙酰化转移酶Rtt109生物学功能

炭疽病是油茶的主要病害,造成巨大经济损失。果生刺盘孢是油茶炭疽病优势致病菌。本研究旨在探讨果生刺盘孢中组蛋白乙酰化转移酶Rtt109的生物学功能,为油茶炭疽病防治提供理论依据。通过构建基因敲除载体,根据同源重组原理,敲除目标基因CfRTT109,进一步筛选获得突变体ΔCfrtt109;构建CfRTT109基因回补质粒,转化至突变体ΔCfrtt109,通过荧光筛选回补菌株。生物学表型测定结果显示：相比于野生型,突变体ΔCfrtt109生长速率下降了51.23%,分生孢子的形成率下降了71.89%;在含有5.0mmol/L内质网胁迫剂二硫苏糖醇的PDA培养基中,突变体ΔCfrtt109的生长抑制率为50.75%,显著高于野生型和回补菌株;荧光定量PCR结果表明,与野生型和回补菌株相比,内质网相关的基因HAC1、SCJ1与PDI1基因在突变体中显著上调表达;在含有DNA损伤试剂甲基磺酸甲酯的PDA培养基中,突变体ΔCfrtt109停止生长;进一步研究发现,在甲基磺酸甲酯胁迫下,突变体ΔCfrtt109中的DNA损伤修复基因RHM52、RHM54与REV1表达量上调幅度显著低于野生型;致病力测...     

围小丛壳Glomerella cingulata子囊孢子交配繁殖、生物学特性及致病性

炭疽叶枯病（Glomerella leaf spot）是我国苹果上新发现的一种病害。为了解围小丛壳Glomerella cingulata子囊孢子的交配方式、生物学特性和致病性,从安徽砀山、山东牟平等地采集病害样品,经分离培养和纯化获得单孢菌株。在适宜条件下单孢菌株可产生子囊和子囊孢子,经过毛细管破子囊壁后单孢分离,获得12个子囊,每个子囊有8个子囊孢子。其中10个子囊中有4个“正”孢子（+）和4个“负”孢子（-）,2个子囊中只有“负”孢子。子囊孢子单孢菌株培养72h,“正”菌株菌落白色,以营养生长为主;“负”菌株菌落灰白色,直径略小于正菌株,菌丝稀疏,边缘菌丝白色,中部有大量橙色的分生孢子堆。“正”、“负”菌株异宗配合后,可产生大量可育子囊壳;单独的“正”菌株有性生殖产生稀疏丛簇状的可育子囊壳;单个的“负”菌株只能产生分散且不育的子囊壳。“正”、“负”菌株菌落的生长速度没有差异,对温度、营养、光照和pH值的敏感性也没有差异,但“正”、“负”菌株的致病性存在差异。正菌株的有性生殖没有导致rDNA-ITS、β-tubulin基因碱基序列变异。     

链格孢柑橘致病型过氧化物酶体对接复合体蛋白AaPex13和AaPex14的生物学功能

过氧化物酶体是存在于真核细胞中的一类单层膜细胞器,参与多种生理生化代谢过程,而Pex13和Pex14是过氧化物酶体膜上的对接复合体蛋白,参与基质蛋白-受体复合体的跨膜运输。目前,Pex13和Pex14在大多数植物病原真菌中的生物学功能尚不清楚。本研究鉴定了柑橘褐斑病菌链格孢柑橘致病型(the tangerine pathotype of Alternaria alternata)的对接复合体蛋白Pex13和Pex14,并构建基因敲除突变体与回补菌株,探究其生物学功能。结果表明,与野生型和回补菌株相比,ΔAaPex13和ΔAaPex14营养生长、分生孢子形成显著下降,分生孢子的萌发率显著降低,抗氧化能力和抗细胞壁胁迫能力也显著减弱,病菌的ACT毒素产量分别降低30%和33%,在离体叶片上丧失致病力。此外,AaPex13和AaPex14的缺失导致基质蛋白无法定位到过氧化物酶体,过氧化物酶体生物发生存在缺陷。本研究明确了AaPex13和AaPex14在病菌生长发育、过氧化物酶体形成、ACT毒素产生以及维持致病力方面都具有重要的调控作用。     

大丽轮枝菌VdSCH9基因的功能研究

大丽轮枝菌是一种土传性植物病原真菌,可侵染多种植物并引发黄萎病。目前,人们关于大丽轮枝菌的侵染和致病机制的了解还很不深入。本文通过敲除大丽轮枝菌编码丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶基因VdSCH9,阐明了其在大丽轮枝菌生长发育及致病过程中的作用。SCH9基因在酵母中的表达与cAMP-PKA途径和TOR信号通路相关,对酵母的生长、压力响应和寿命等有重要作用。大丽轮枝菌VdSCH9敲除突变体的生长速率显著下降,菌落边缘菌丝更为稀疏,菌丝分枝减少,对棉花植株为害的平均病情指数为56.6,显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数90.5和82.8,对茄子植株为害的平均病情指数为65.9,也显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数91.1和89.8。另外,敲除突变体对于高渗透压、氧化还原压力、细胞膜和细胞壁完整性等压力条件的敏感性增强。因此,VdSCH9对于大丽轮枝菌的生长、压力响应及致病力均有重要作用。