小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁层对红系祖细胞生长的影响

本实验以Dexter培养体系作小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁培养。在所获的基质细胞贴壁层上作红系造血祖细胞集落培养,观察两种来源造血基质细胞对红系集落生长的影响。实验结果表明,胎肝造血基质细胞贴壁层能明显促进早期红系造血祖细胞(BFU-E)形成集落,却不明显影响晚期红系造血祖细胞(CFU-E)的生长。成年小鼠骨髓造血基质细胞贴壁层对BFU-E和CFU-E均有刺激生长的作用;但对前者生长的刺激性影响较胎肝造血基质细胞贴壁层为弱。造血基质细胞贴壁层对红系集落生长的促进作用主要是通过体液因子实现的,细胞间短距离调节的影响亦不能除外。     

人体骨髓长期培养中粘壁层的基质细胞

应用免疫荧光技术对人体骨髓长期培养(HLTBMC)粘壁层细胞作了研究,发现在不同的基质细胞中有着下列表面标记:基质成纤维细胞CD 10~+,FIB 86.3~+,CD 13~+,CD 71~+;脂肪细胞CD 10~+,FIB 86.3~+,CD 13~+,CD71~+/-,CD 14~+,CD 33~+,CD 25~+,HLA-DR~+,CD 19~+,CD 5~+,基质成纤维细胞的标记与两次传代的骨髓成纤维细胞以及皮肤和脾脏的成纤维细胞相似。HLTBMC中的成纤维细胞较之非巨噬细胞的小圆形造血细胞,数量上占很大的优势,加之镀银染色发现网状纤维增多,提示HLTBMC后期造血活性的消失可能与临床上的骨髓纤维化有着相似的机理。     

白刺珠心组织及其营养功能的超微结构观察

白刺具厚珠心,珠心组织发达。原胚期,根据超微结构特征,珠心组织大体可区分为三层:外围不活跃细胞层、特化细胞层和胚囊外围解体细胞层。珠心细胞解体时,细胞壁首先以微纤丝状态分散,原生质不同程度破坏,并累积脂滴。近胚囊壁降解后,珠心细胞即成为开放细胞,原生质团游离到胚囊周围。胚囊壁在珠孔区和合点区间断,因之,珠心细胞的游离原生质团可直接迁入胚囊内。在胚囊壁和中央细胞质膜之间存在明显间隙区域,其中有大量壁旁体存在,是珠心细胞降解物质进入胚囊的另一重要途径。     

间充质干细胞体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化

研究间充质干细胞(MSC)能否在体外调控造血。体外分离培养人骨髓来源的MSC,RT-PCR检测其造血生长因子的表达,并以其为饲养层细胞,接种骨髓单个核细胞(MNC),观察生长情况,并通过形态学观察和流式细胞术分析,鉴定细胞来源和分化方向。结果显示,MSC构成性表达SCF、Flt3L和M-CSF,不表达C-CSF和GM-CSF,在骨髓MNC和MSC共培养体系中,大约2周左右可以看到大量的圆形细胞粘附在梭型MSC上生长,细胞胞体为圆形,胞浆较丰富,胞核为圆形、半月型或肾型,部分细胞呈典型的单核细胞形态,流式细胞术分析该类细胞表达CDl4,不表达CDl5、CD41、glycophorin A、CD5和CDl9。表明不需要添加外源性造血生长因子,间充质干细胞能在体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化,其定向分化可能与MSC分泌造血生长因子及MSC与造血细胞间相互作用有关。     

问充质干细胞体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化

研究间充质干细胞(MSC)能否在体外调控造血.体外分离培养人骨髓来源的MSC,RT-PCR检测其造血生长因子的表达,并以其为饲养层细胞,接种骨髓单个核细胞(MNC),观察生长情况,并通过形态学观察和流式细胞术分析,鉴定细胞来源和分化方向.结果显示,MSC构成性表达SCF、Flt3L和M-CSF,不表达G-CSF和GM-CSF,在骨髓MNC和MSC共培养体系中,大约2周左右可以看到大量的圆形细胞粘附在梭型MSC上生长,细胞胞体为圆形,胞浆较丰富,胞核为圆形、半月型或肾型,部分细胞呈典型的单核细胞形态,流式细胞术分析该类细胞表达CD14,不表达CD15、CD41、glycophorin A、CD5和CD19.表明不需要添加外源性造血生长因子,间充质干细胞能在体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化,其定向分化可能与MSC分泌造血生长因子及MSC与造血细胞间相互作用有关.     

多发性骨髓瘤的骨髓细胞长期培养的研究

多发性骨髓瘤的骨髓细胞置于Dexter长期培养体系中,浆细胞可以长期生长。非贴壁层细胞形成CFU-GM的能力达6周以上,但随着培养时间的延长,CFU-GM的形成活性明显下降。浆细胞产生兔疫球蛋白单克隆特异性在Dexter长期培养体系中仍维持不变,但Ki-67阳性的浆细胞随着培养时间的延长而减少,以上结果说明浆细胞虽然可以在Dexter培养体系中生长并保持单克隆特异性,但此种培养体系不是浆细胞最佳的生长条件。本研究还表明Dexter长期培养不宜作为骨髓净化的手段用于多发性骨髓瘤的自体骨髓移植。     

小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察

目的　观察小鼠胚胎干细胞在六种培养体系中的生长情况。方法　小鼠胚胎干细胞 (ESD3细胞株 )在以下六种培养体系中培养 :1 .原代小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)有血清培养 ,2 .MEF无血清培养 ,3.SNL细胞有血清培养 ,4.LIF(白血病抑制因子 )有血清无饲养层培养 ,5.LIF无血清无饲养层培养 ,6.大鼠肝细胞 (BRL)条件培养基培养。经体外培养 1 0代后 ,观察其克隆形态 ,同时进行碱性磷酸酶检测并将ES细胞接种于裸小鼠皮下 ,观察ESD3的未分化状态和多潜能性。结果　六种培养体系培养的ESD3具有典型的ES细胞克隆形态 :巢状 (集落状 )隆起生长 ,边缘清楚 ,表面平滑 ,结构致密 ;AKP强阳性 ;裸小鼠体内形成了由多种组织构成的畸胎瘤。结论　六种培养体系均能支持ESD3生长 ,并能保持其未分化性和多潜能性 ,为ES细胞的应用研究奠定了良好的基础。     

兔BMSCs复合纤维蛋白胶在体外分化为角膜基质细胞的研究

目的：探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为角膜基质细胞的可行性,并观察纤维蛋白胶（FG）作为细胞支架材料的效果。方法：密度梯度法获得BMSCs,体外诱导实验将细胞分为三组：对照组用普通培养皿、BMSCs培养条件并不加角膜基质细胞共培养的条件下培养;非FG共培养组使用普通培养皿并与角膜基质细胞共培养诱导BMSCs分化;FG共培养组使用铺有FG的培养皿并与角膜基质细胞共培养诱导BMSCs分化。培养1w及2w后用WestenBlot法检测三组细胞Keratocan的表达,在相差显微镜下进行形态学观察。结果：原代培养的BMSCs表现出成体干细胞潜能,CD29染色阳性,符合骨髓基质干细胞的特征。诱导培养2周后对照组BMSCs融合成单层、呈条索状生长;非FG共培养组部分细胞体积变小、多突起,局部呈梭形生长;FG共培养组细胞生长状态良好,部分细胞呈梭形或纺锤形,与FG生物相容性好。Westen检测结果：BMSCs细胞在纤维蛋白胶或普通培养皿上特定培养条件下均能诱导表达角膜基质细胞的特异性蛋白Keratocan。结论：骨髓间充质干细胞在条件培养基下可分化为角膜基质细胞,有望作为治疗角膜疾病及角膜组织工程的备选材料,纤维蛋白胶组织相容性好,可为组织工程提供移植细胞片。     

皮肤细胞复合改性聚乳酸构建组织工程皮肤

目的:探讨以改性聚乳酸为细胞外基质网架构建组织工程皮肤的可行性。方法:采用盐溶法制备机械性能得到部分改进的聚乳酸多孔泡沫网架,向改进的聚乳酸网架接种真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞,以普通聚乳酸支架作为对照,构建组织工程皮肤。体外培养一周,对网架进行形态学观察。主要观察指标:①一般形态观察②组织学观察。结果:复层组织工程皮肤在结构上与正常皮肤相似,具有真皮、表皮双层结构。改性聚乳酸网架上有双层细胞生长,生长的细胞与网架接触,并且在其表面形成较为明显而连续的细胞层。随着培养时间的延长,发生了一系列变化:表皮部分细胞层数逐渐增多,真皮部分细胞也逐渐增多,并向表皮层深入,位于表皮与网架之间。结论:双醛淀粉作为良好的增柔剂在改善聚乳酸网架的机械性能的同时,也具有良好的细胞相容性,不影响细胞的生长增殖和代谢,可以进一步用作组织工程皮肤的支架材料。     

狗骨髓长期培养的贴壁层细胞及条件培养液对粒系祖细胞的影响

本文报告狗骨髓长期培养的初步研究结果。采用马血清与狗血清混合加入培养体系中,可建立起比较稳定的贴壁细胞层,可以维持19周以上。但是,这种贴壁层不能有效地维持造血干细胞的增殖与分化,上清液中血细胞与GM-CFU_C的数目,在第二次接种骨髓后2—3周即迅速下降。狗骨髓培养的条件液中存在着抑制GM-CFU_C生长的物质,但它对小鼠骨髓GM-CFU_C和CFU-S无影响。如以贴壁细胞作为底层,用双层琼脂平皿培养法与正常狗骨髓共同培养,发现贴壁细胞不仅没有抑制反而有加强CSF刺激GM-CFU_C生长的作用。因此对狗骨髓长期培养体系不能长期支持造血干细胞生长和繁殖的可能原因尚须作进一步探索。     

模拟微重力条件下 WB-F344细胞的三维培养

与传统的单层平面培养相比,细胞三维培养可更好地模拟生物体内细胞的生长状态和微环境.以Cytodex-3微载体为支持物,利用旋转式细胞培养系统（RCCS）模拟微重力条件,悬浮培养法构建大鼠WB-F344细胞微重力三维培养模型.并通过细胞计数、光学显微镜、透射电镜、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术等方法分析了细胞增殖、显微结构、粘附分子及钙粘蛋白（E-cadherin）表达情况.结果表明,模拟微重力三维培养条件下WB-F344细胞增殖块,呈紧密多层排列、可见丰富的微绒毛和线粒体、胞间有桥粒和紧密连接形成,细胞粘着力加强、表现出良好的三维生长特征;与静置三维培养相比,纤粘连蛋白（Fn）mRNA表达呈上调趋势,细胞内E-cadherin表达量增加,这可能是微重力效应下细胞粘附力增强的部分机制.该培养体系可能有利于细胞之间,细胞与胞外基质之间相互作用及其作用机制的研究.     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础。方法比较小鼠胚胎干细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测。结果ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性。结论研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性。     

无巨核细胞条件下促血小板生成素对骨髓基质细胞纤维形成的影响

目的：观察无巨核细胞存在的条件下促血小板生成素能否刺激骨髓基质细胞纤维形成。方法：用改良Dexter培养法进行体外不同浓度促血小板生成素（TPO）作用下的基质细胞培养,在培养过程中检测基质细胞相对增殖指数,纤维连接蛋白、层粘素和Ⅳ型胶原的表达,以及Ⅲ型前胶原蛋白的合成。结果：TPO可刺激基质细胞增殖,相对增殖指数随TPO浓度增加而增强,但不随作用时间延长而增强;纤维连接素、层粘素和Ⅳ型胶原在对照组与实验组均有阳性表达,但实验组强于对照组,但阳性强度不随培养时间的延长而增强;标记的Ⅲ型前胶原蛋白平均荧光强度实验组高于对照组,差异明显,但这种作用的强弱与TPO浓度相关性不强。结论：无巨核细胞存在的条件下,TPO可直接刺激骨髓基质细胞产生细胞外基质和胶原,促进其纤维形成。     

拟豆寇种子的解剖学和组织化学研究

拟豆寇（Paramomum petaloideum)种子包括假种皮,种皮,外胚乳,内胚乳和胚,假种皮膜质,由5－7层薄壁细胞构成,种皮分外种皮,中种皮和内种皮,外种皮由一层细胞构成,其壁增厚并木质化,中种皮包括下皮导,透明细胞层和色素层,下皮由一层细胞构成,细胞近长方形,半透明细胞层由一层细胞组成,细胞近长方形或长条形,形态上与色素层细胞相似,但可通过染色方法把二者区分,色素层由一至二层细胞构成,最内层细胞形态有时难以分辨,内种皮由一层内切几壁非常增厚的石细胞构成,珠孔区分化出珠孔领,孔盖和珠孔区薄壁细胞,珠孔领导形型,孔盖具有石细胞硬具,合点区内种皮内凹陷并出现缺口,缺口位于种子近顶部偏向背侧,缺口间的合点区色素细胞群整体轮廓呈喇形,壁呈波浪形的外胚细胞富含淀粉粒,内胚乳最外一层细胞体积小,富含脂类物质,内胚乳合点端多层细胞,珠孔端为一层细胞,含丰富蛋白质,脂类物质主要存在于胚中,本文还从种子解剖学角度讨论了拟豆寇的系统位置。     

昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)滋养层,用于昆明小鼠胚胎干细胞的培养。方法:取妊娠13.5的胎鼠,采用组织消化法分离培养出原代成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察;MTT法筛选丝裂霉素C(MMC)作用的最佳浓度和时间;取妊娠3.5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果:MEFS为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第三代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老;MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是10ug/ml作用2.5～4h,20ug/ml作用1-2.5h。妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成典型的"鸟巢"状干细胞集落,并可维持胚胎干细胞的正常形态且不发生分化。结论:这种方法制备的滋养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

茴香砂仁种子的解剖学和组织化学研究

茴香砂仁种子的假种皮膜质,由内、外表皮及其间的数层薄壁细胞构成,种皮黑褐色,由外种皮、中种皮和内种皮组成,外种皮为1层表皮细胞;中种皮由1层细胞的下皮层,1层细胞的半透明细胞层、3-4层薄壁细胞的中种皮薄壁细胞层和1层细胞的色素细胞层组成,内种皮由1层径向延长的细胞构成,内切向壁与部分径向壁非常增厚,种子珠区分化出珠孔领,孔盖和珠孔区薄壁细胞,合点区内种皮出现缺口,缺口间的合点区色素细胞群整体轮廓呈刺叭状,珠孔端的则为1层细胞,细胞内含蛋白质、多糖、脂类物质,胚含量脂类物质,还含有蛋白质与多糖。     

胶原蛋白-壳聚糖支架的构建及其与骨髓基质干细胞复合的实验研究

目的:构建一种组织工程神经支架,并观察体外培养的骨髓基质干细胞在其内部的生长情况,为后续种子细胞的移植提供阶段性实验数据.方法:以Ⅰ型胶原蛋白和壳聚糖为原料通过冷冻干燥技术制备神经支架,扫描电镜观察其内部结构,测量其孔径大小、孔隙率等指标.将体外培养的骨髓基质干细胞与Ⅰ型胶原蛋白-壳聚糖神经支架复合,共培养2天;扫描电镜观察细胞在支架内部的生长情况.结果:构建的神经支架均为圆柱状,内部为纵向平行排列的孔径均匀的微管样结构,细胞紧密贴附在支架微孔内壁上,细胞生长状况良好.结论:Ⅰ型胶原蛋白-壳聚糖支架具有良好的内部三维结构和生物相容性,可与细胞复合后用于修复周围神经缺损.     

舞花姜种子的解剖学和组织化学研究

舞花姜种子表面只许多表皮毛,基部具黄白色的种阜状结构。假种皮着生于种阜结构内缘,基部筒状,中上部指状分裂;假种皮细胞长条形．内含许多细小淀粉粒。种皮由外珠被发育而来．可划分为外种皮、中种皮与内种皮。外种皮由具３—５（６）层表皮细胞的复表在构成,最外层的一些表皮细胞向强突起形成表皮毛。中种皮由下皮层、半透明细胞层、中种皮薄壁细胞层与色素层构成。下皮层由一层下皮细胞构成,细胞内充满结合有单字的红褐色色素;半透明细胞含有与脂类结合的淡黄褐色无定形块状物,中种皮薄壁细胞内无色素或任何颗粒状物;色素层为中种皮最内方的一层,细胞体积大、充满与单宁结合的红褐色色素。内种在由一层体积小、壁局部增厚的砖形薄壁细胞构成,其机械保护作用小。种子在珠孔区分化出珠孔领、孔盖及种阜状结构。珠孔领为异形型,孔盖不具石细胞硬层。种阜状结构以其细胞层数增多、壁增厚并本质化的复表皮加强了珠孔区的机械保护作用。合点区内种皮出现缺口．缺口间充满通常呈多角形的合点区色素细胞,其整体轮廓为长条形。外胚乳细胞壁平直,细胞内充满淀粉粒,部分细胞还含有少量的蛋白质与脂类：近合点外胚乳形成一薄区。内胚乳细胞含有蛋白质、脂类与淀粉．其细胞轮廓清楚,椭圆形或不规?     

模拟微重力条件下WB-F344细胞的三维培养

与传统的单层平面培养相比,细胞三维培养可更好地模拟生物体内细胞的生长状态和微环境。以Cytodex-3微载体为支持物,利用旋转式细胞培养系统(RCCS)模拟微重力条件,悬浮培养法构建大鼠WB-F344细胞微重力三维培养模型。并通过细胞计数、光学显微镜、透射电镜、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术等方法分析了细胞增殖、显微结构、粘附分子及钙粘蛋白(E-cadherin)表达情况。结果表明,模拟微重力三维培养条件下WB-F344细胞增殖块,呈紧密多层排列、可见丰富的微绒毛和线粒体、胞间有桥粒和紧密连接形成,细胞粘着力加强、表现出良好的三维生长特征;与静置三维培养相比,纤粘连蛋白(Fn)mRNA表达呈上调趋势,细胞内E-cadherin表达量增加,这可能是微重力效应下细胞粘附力增强的部分机制。该培养体系可能有利于细胞之间,细胞与胞外基质之间相互作用及其作用机制的研究。     

黑斑蛙视网膜3种神经内分泌细胞的免疫组织化学定位

目的研究神经肽Y(NPY)、五羟色胺(5-HT)和胰高血糖素(GLU)免疫阳性细胞在黑斑蛙(Rananigromaculata)视网膜上的组织学定位。方法应用过氧化物酶标记的链霉亲和素(SP法)免疫组织化学技术,并结合生物统计学分析。结果NPY细胞主要分布于内核层和节细胞层。内核层中出现两种阳性细胞,一种出现在第2、3亚层,常为多个细胞聚集;另一种出现在内侧,有突起伸入内网层。节细胞层阳性细胞分布较少,胞体有大小之分。5-HT细胞主要分布于内核层和节细胞层,位于内核层中邻近内网层一侧的阳性细胞有突起延伸入内网层。GLU细胞分布于外核层、内核层内侧以及节细胞层。结果 黑斑蛙视网膜上NPY、5-HT和GLU细胞的分布与其它物种有相似之处,也有其自身特点,符合其晨昏性生活习性。