利用转基因技术生产可预防霍乱的可食性番茄疫苗

TrangenicResearch 2 0 0 2年 1 0月 1 1卷 5期 4 47～ 4 5 4页报道 :霍乱是一种由霍乱弧菌 (Vibriocholerae)引起的烈性传染病。霍乱弧菌所分泌的毒素可导致严重腹泻。霍乱毒素由 1个A单位和 5个B单位组成。五聚B部分是有效的免疫辅剂。目前正在研制霍乱疫苗。已研制成功了由霍乱毒素亚单位B(CTB)与灭活的霍乱弧菌细胞混合而成的口服疫苗 ,可预防霍乱 (Sanchez等 ,1 993)。但由于CTB的造价太高 ,故不适于发展中国家生产疫苗使用。为此 ,近年来已开始利用转基因植物生产用于防治疾病的蛋白 (例如Fischer等 ,2 0 0 0 )。由于将抗原表达…     

O1或O139霍乱疫苗对异群霍乱缺乏交叉保护

O1和O139霍乱弧菌是引起急性腹泻的病原微生物,用这两群菌的灭活全菌体与重组霍乱毒素B亚单位构建的亚单位／菌体型疫苗免疫队CA小鼠,对本群菌的攻击可提供良好免疫保护,而对异群霍乱菌则缺乏交叉保护作用。     

冻干口服霍乱rBS-WC菌苗安全及效率评价的小鼠模型探讨

我们构建了高产、分泌霍乱毒素B亚单位的工程菌株E.coli MM2,并用该菌株生产的重组霍乱毒素B亚单位(rBS)与灭活霍乱弧菌菌体制成冻于口服rBS-WC菌苗。这一菌苗的实验室动物研究亦已进行,肯定其在多种动物安全、有效。目前已能较大量地生产rBS,正在探索放大与工业化生     

阿拉伯启动子控制的霍乱毒素B亚单位基因在大肠杆菌中的表达

霍乱毒素B亚单位是预防霍乱重要的保护性抗原,由霍乱毒素B亚单位组成的新的口服疫苗已经大量人体试验证明安全有效,此外霍乱毒素B亚单位是很强的粘膜免疫原,当与无关抗原结合在一起口服时,也是一个很好的佐剂。为获得大量霍乱毒素B亚单位,采用DNA重组技术,将霍乱毒素B亚单位基因与阿拉伯糖操纵子的表达载体pMPM-A4Ω质粒进行重组,pMPM-A4Ω表达载体是由阿拉伯糖(L-ara)所调控,具有高拷贝表达的特点。我们成功地构建了重组质粒和工程菌菌株,对其     

嗜肺军团菌mip/ctxB融合基因体外表达与动物免疫试验的免疫原性研究

ＰＣＲ扩增嗜肺军团菌mip基因和霍乱弧菌ctxB基因,克隆入载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR、序列分析鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-mip/ctxB.脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-mip、pcDNA3.1-mip/ctxB转染NIH3T3细胞,用免疫荧光法和蛋白质印迹鉴定瞬时表达和稳定表达产物,结果发现：重组质粒成功转入细胞并获得短暂表达,稳定转染细胞分别在24 ku和35 ku处检测到阳性杂交信号.将pcDNA3.1-mip、pcDNA3.1-mip/ctxB作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性等体液免疫和细胞免疫反应的指标,评价疫苗的免疫原性.结果发现：各实验组均检测到免疫原性,pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组的免疫原性高于pcDNA3.1-mip免疫组,有显著性差异(P＜0.01).研究结果为mip/ctxB融合基因DNA疫苗的研制提供了初步的实验依据.     

B型肉毒毒素重组Hc亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:用大肠杆菌表达重组B型肉毒毒素受体结合区Hc抗原(BHc)作为亚单位疫苗,并研究其免疫原性。方法:构建pTIG-Trx-BHc原核表达载体,用大肠杆菌表达并纯化重组BHc抗原;免疫BALB/c小鼠以研究它的免疫原性。结果:大肠杆菌表达并纯化获得了重组BHc抗原,免疫小鼠后能刺激机体产生高效价的抗BHc抗体和保护性免疫反应。该重组BHc亚单位疫苗1μg剂量2次免疫小鼠即可产生对104LD50剂量B型肉毒毒素攻毒的完全保护,血清中和效价可达1.33 IU/m L。结论:大肠杆菌表达的重组BHc抗原具有良好的免疫原性,能够有效地保护小鼠抵抗B型肉毒毒素的攻击,该BHc抗原能够作为亚单位候选疫苗预防B型肉毒毒素中毒。     

幽门螺杆菌重组vacA-ctxB蛋白的基因克隆与表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)vacA毒性片段与霍乱毒素B亚单位(ctxB)基因的原核表达载体,并诱导表达VCTB重组蛋白,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法以H.pylori基因组DNA为模板,PCR扩增vacA毒性片段基因,克隆至质粒pQE30中,获得重组质粒pQE30-vacA。再以pET32(a) -ctxB质粒为模板PCR扩增ctxB目的基因并插入pQE30-vacA中,构建含双基因的表达质粒pQE-vctB。克隆至大肠埃希菌Top10,并在DH5α中诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,Ni-NTA柱纯化后Western blot鉴定其抗原性,免疫家兔后ELISA法检测血清中VacA和CtxB抗体鉴定其免疫原性。结果vacA的DNA片段为723 bp左右。ctxB基因的DNA片段为372 bp左右,与预计长度相符合。测序结果vctB融合基因由1092 bp组成,编码364个氨基酸残基的多肽,与基因文库相符。表达蛋白VCTB经SDS-PAGE分析,相对分子量为40 000,与预期的一致;表达量约占菌体总蛋白的20%,提纯后SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上。Western blot鉴定能与抗VacA人血清发生特异性反应,ELISA测定能与抗ctxB兔血清发生特异性反应。结论含vctA和ctxB融合基因的表达载体构建成功,并在大肠埃希菌DH5α中表达了重组蛋白质VCTB,表达蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于制备口服疫苗。     

抗霍乱毒素B亚单位合成肽抗体的特性

<正> 有几个研究小组已报道霍乱毒素B亚单位合成肽能有效激发产生抗霍乱毒素的中和抗体。该合成肽有希望表现出霍乱毒素的生物功能,它对于研究霍乱毒素B亚单位的结构与功能(霍乱毒素结合GM_1-神精节苷脂和毒素进入细胞膜内分化)很有帮助。 我们根据霍乱毒素B亚单位结构制备出合成肽并检测了它的生物学活性。 1)根据Merrified的固相法我们合成了3个肽,CTB30-48,CTB41-50和CTB84-97(数字代表B亚单位N末端氨基酸残基的限定位置)。在合成中承蒙大阪大学Dr_1 Shimonish合作。 2)用肽-BSA(牛血清白蛋白)结合体免疫家免制备的抗肽血清与霍乱毒素呈     

霍乱毒素B亚单位基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达

本工作成功地将霍乱毒素B亚单位(ctx B)基因插入到带有天门冬氨酸β-半醛脱氢酶基困(asd+)的pYAZ48质粒中,并将它转化至天门冬氨酸β-半醛脱氢酶突变(asd-)鼠伤寒沙门氏菌中。实验结果表明,ctx B亚单位基因能在鼠伤寒沙门氏菌中高效表达,并且表达的蛋白能分泌到细胞外。动物实验结果也表明：该疫苗菌株能在肠粘膜细胞定居;口服及全身免疫均能产生较高的抗体,并能增强动物细胞的免疫功能;对伤寒、霍乱有毒株的攻击有良好的保护效果。该系统的应用为疫苗基因工程提供了一个新的途径。     

临床试验评估口服肠毒原性大肠杆菌原型疫苗的安全和免疫原性

作者开发了一种新的抗肠毒原性大肠杆菌（ETEC）腹泻的口服疫苗,这种疫苗含有表达水平提高的ETEC定居因子（CFs）和重组蛋白（LCT-BA）,即大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位与霍乱毒素B亚单位的重组蛋白的灭活重组大肠杆菌。作者进行了随机、双盲有对照的I期临床试验,60名瑞典成人志愿者参与了此项研究,观察了这种原型疫苗的安全性和免疫原性,并与以往开发的口服ETEC疫苗的结果进行比较,以往开发的疫苗为口服ETEC疫苗,这种疫苗含有CTB和灭活的表达CFA／I的野生型ETEC菌株（参考疫苗）。志愿者分组接受2剂或者是原型疫苗或者是参考疫苗。原型疫苗以相同剂量或者以4倍的剂量（与参考疫苗相比）进行投递。     

幽门螺杆菌HspA融合蛋白口服疫苗的构建

构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原分热休克蛋白A亚单位(HspA）和霍乱毒素B亚单位（CtxB）的重组融合蛋白的生物工程菌株,以此制备幽门螺杆菌的口服疫苗。用PCR方法扩增hspA和ctxB两个目的的基因片段,将它们分别克隆至pSK（＋）质粒上,然后插入含T7启动子ET－22b（＋）的表达载体中,构建嗓基因的表达质量pET－hct,转化E.coliBL21(DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT。经测序,hspA-ctxB(hct)融合基因片段由726bp组成,可以编码242个氨基酸残基的多肽。经SDS－PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量约为30kD。融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,和HspA共同标记同位素^125I,然后给小鼠灌胃,结果观察到HCT组小鼠血清中的^125I的放射量要明显高于HspA组（P＜0．001）,且吸收峰值时间明显提前。融合蛋白中的CtxB可明显促进小鼠对HspA的吸收,HCT融合蛋白可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的侯选口服疫苗。     

幽门螺杆菌重组vacA-CtxB蛋白的原核表达及免疫学研究

目的原核表达幽门螺杆菌pQE-vctB(含H.pylori细胞空泡毒素毒性片段与霍乱毒素B亚单位的融合基因)在E.coil DH5α中诱导表达,以获得重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法 (1)pQE-vctB转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达重组蛋白VCTB,Western blot分析抗原性,镍离子柱纯化。(2)重组蛋白VCTB口服免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性IgG、小肠冲洗液IgA,以鉴定其免疫原性。结果重组蛋白VCTB经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为40kD,亲和层析后可获得纯度为92%以上的蛋白。Western blot分析显示能与VacA抗血清反应。ELISA检测显示,免疫小鼠的血清特异性抗体IgG,肠粘液IgA显著高于VacA对照组(P0.01)。结论 vacA和ctxB融合基因原核表达质粒转化E.coli DH5α表达菌获得了重组蛋白VCTB,表达量较高,纯度较高,有良好的抗原性和免疫原性,口服免疫小鼠可明显提高其免疫效果,产生较高水平的IgA,可用于制备防治H.pylori感染的口服疫苗。     

安全的霍乱活菌苗?

<正> 当前使用的霍乱菌苗有两大类,一是由全菌体加或不加毒素B亚单位组成的死菌苗,给苗途径可肠道外或口服;二是口服活菌苗,由霍乱弧菌基因工程减毒株或由表达霍乱抗原的异源载体菌(即伤寒Tyzla)组成。前一类费钱效果不理想,后一类有反应原性、变异性和稳定性方面的问题。 最近,我们鉴别出了菌毛定居因子(协同调节的毒素菌毛( toxin coregulated pil-usTCP),它可能是审定菌苗可否应用的一种重要的新免疫原。本文介绍TCP菌毛应用于霍乱菌苗研究中的一些初步结果。     

工程菌产霍乱肠毒素B亚单位的纯化

 本实验室使霍乱肠毒素(CT)B亚单位基因在大肠杆菌中获得表达,并能分泌到胞外。将该菌株培养物上清经过超滤浓缩后,用偶联上霍乱毒素IgG的CNBr-Sepharose 4B进行亲和层析,得到表达产物霍乱毒素B亚单位纯蛋白。经PA-GE、HPLC及琼脂免疫扩散等方法鉴定证明该蛋白与天然霍乱肠毒素B亚单位完全相同。     

构象稳定的破伤风毒素Hc 片段突变体 (HcM) 的制备及其免疫原性分析

破伤风是由破伤风杆菌侵入人体伤口、生长繁殖、产生毒素而引起的一种急性特异性感染,其死亡率高,严重危害人民生命健康。研究证实破伤风毒素重链C端 (Hc) 具有与毒素受体结合的活性,完全保留了全分子的免疫原性,有望开发成为新的基因工程破伤风亚单位疫苗以替换传统的甲醛灭活类毒素疫苗。由于野生型Hc蛋白 (HcW) 易形成分子间及分子内二硫键,且各构象分子之间易发生不稳定的转换,为疫苗的生产工艺带来困难,因此,通过将破伤风HcW蛋白的869位半胱氨酸突变为丙氨酸,构建构象稳定的破伤风亚单位疫苗突变体HcM,对Hc     

噬菌体随机肽库筛选抗志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的单抗的识别表位

目的利用噬菌体随机肽库技术筛选志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的单抗的识别表位。方法以抗志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的单克隆抗体筛选噬菌体随机12肽库,挑取阳性克隆测定DNA序列,推导其氨基酸序列并进行同源性分析。通过ELISA鉴定获得的噬菌体短肽与单抗之间的结合特性。结果从噬菌体随机12肽库中筛选出20株可与抗志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的单抗特异结合的噬菌体克隆,其中多数克隆呈现核心序列WTSRW（Q）,该序列与志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的一级序列具有一定的同源性。结论WTSRW（Q）序列是志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B单抗的识别表位。     

霍乱cT-B和LPs-o双价抗原工程菌苗株的构建

作者将霍乱弧菌O抗原及毒素B亚单位基因片段,经DNA体外重组技术,得到了能表达双价抗原的工程菌株1046(pMG305)。经GM1-ELISA分析表明该菌株能够表达特异的霍乱CT-B抗原,且能分泌到胞外,通过菌体凝集,全细胞O抗原酶联分析和血凝抑制试验表明在1046(pMG305)菌体表面表达了霍乱的O抗原,它的脂多糖O抗原通过SDS-PAGE电泳分析,显示它表达了霍乱LPS的特征区带。小鼠腹腔免疫后用霍乱弧菌毒株攻击表明,有良好的保护作用,因此1046(pMG305)可望成为霍乱活疫苗的候选株。     

流感HA疫苗鼻内接种中联合使用霍乱毒素B亚单位可加强DTH应答

<正>为提高普通疫苗和合成疫苗的功效,有必要寻找出安全、有效的用于人体的适宜佐剂。近来我们已报导了霍乱毒素B亚单位(CTB),它作为佐剂用于鼻内流感HA疫苗免疫大有希望。即:BALB/c小鼠以A型流感病毒HA疫苗和CTB联合鼻内接种后,即可产生高水平鼻内IgA抗体,这种抗体与不同的A型流感病毒HA疫苗有交叉反应性,又可诱发对病毒攻击的交叉抗性。     

孟加拉高砷低砷区儿童对口服灭活霍乱疫苗的特异免疫应答及其EPI疫苗

<正>背景:对口服灭活全菌体霍乱毒素B(CTB)亚单位霍乱疫苗Dukoral和国家免疫接种体系中的3种儿童疫苗的免疫应答,在生活于孟加拉高砷和低砷污染区的儿童中进行了比较,并对他们的血清补体因子C3和C4水平进行了评估。疫苗接种:2~5岁的儿童口服两剂Dukoral,间隔14天。受试者亦根据孟加拉扩大的免疫规划(EPI)接受了白喉、破伤风和麻疹疫苗。     

应用正交实验法优化大肠杆菌表达CTB-PSMA624-632蛋白的条件

通过基因工程方法,将含霍乱毒素B亚单位(CTB)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)表位肽的重组质粒pET28a-CTB-PSMA624-632,转化表达宿主菌BL21 (DE3)。CTB蛋白的表达有利于开发粘膜佐剂和霍乱弧菌基因工程疫苗,同时抗原肽疫苗也是肿瘤免疫治疗的理想候选。本研究采用正交实验法,优化条件以增加大肠杆菌中CTB-PSMA624-632蛋白的表达量。选取了5个单因素作为考察因子,分别为:预诱导时间、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导转速。先做了4水平的实验L16(45)。根据极差分析的数据对影响较大的3个因素又做了细调型的3水平实验L9(33)。结果表明,在早期指数生长期的诱导能得到相对高水平的包涵体形式的CTB-PSMA624-632蛋白,并且此蛋白的表达随着诱导温度升高到37℃而逐渐增加;相比于使用正常浓度的IPTG诱导得到的蛋白表达量,用100%μmol/L诱导足以诱导蛋白的表达,这比通常使用的IPTG浓度小10倍;此外,诱导时间5 h与7 h对蛋白的表达量差距甚微,因此选定较短时间的5 h,240 r/min的诱导转速也被认为是能诱导目的蛋白CTB-PSMA624-632具有高表达量的最优条件。