噬菌体显示技术改造人干扰素α1c/86D的研究

利用噬菌体表面显示技术表达具生物活性的干扰素α1c,并通过构建和筛选突变文库 ,以得到高受体结合能力和高比活性的新α1c干扰素 .利用噬菌粒载体pCANTAB5E表达了人IFNα1c/ 86D基因 ,利用随机 6肽库和干扰素的中和抗体推导干扰素α1c的受体结合区及关键性结合残基 ,运用盒式突变构建了基于AB环的突变库 ,其中氨基酸 2 9,3 1,3 2 ,3 5位完全随机化 ,并直接利用WISH细胞选择出高抗病毒活性的干扰素突变体 .结果获得了 3个重组噬菌体干扰素突变体 ,其抗病毒活性是干扰素母体的 4～ 16倍 .这一结果为国内外首次报道利用噬菌体表面显示技术的筛选表达优势改造干扰素以提高抗病毒活性 ,实验结果说明了其可行性 ,并提示干扰素突变体的比活性有可能较母体高 .     

人干扰素α1c／86D AB环突变文库的构建及细胞筛选

人干扰素α１ｃ／８６ＤＡＢ环突变文库的构建及细胞筛选马学军胡荣１吕海２魏开坤张丽兰薛水星侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所,病毒基因工程国家重点实验室北京１０００５２）噬菌体表面呈现（ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术是由Ｓｍｉｔｈ〔１〕博士于１９...     

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。     

人α1型干扰素突变体(IFN-α1/86D)的组建及其生物学活性的研究

本文采用核苷酸指导下的定位突变方法,以Asp置换了人α型干扰素86位的Cys,构建成突变体IFN-αI(86D)。后者在大肠杆菌中的表达水平比其母株(IFN-αI/86C)提高了2.8倍,IFN-αI(86D)在4℃的稳定性也较母株为高。     

重组人IFNα1c/86D/22R/27F在大肠杆菌中的表达及活性研究

利用重组PCR点突变技术将人IFNα 1c/ 86D的第 2 2、2 7位的Ser编码序列突变为Arg和Phe ,DNA测序正确 ,并在大肠杆菌BL2 1中表达 ,表达量为 19%。采用CM Sepharose、DEAE SepharoseFF纯化后WesternBlot检测为单一条带。细胞病变抑制法测定其比活为 3.5 1× 10 7U/mg ,较IFNα 1b( 1.5 5 10 7U/mg)略高。抗A5 4 9细胞的增殖活性与IFNα 1b相当。     

Engineering human interferon α1c/86D with phage display technology

Human interferon-α1c/86D (IFNα1c/86D) was functionally displayed on the surface of the filamentous bacteriophage using a phagemid vector system (pCANTAB5E). The key amino acid residues involved in the receptor binding were further defined with phage displayed 6-mer peptide library and two neutralizing antibodies against linear epitopes on the IFN-α1b, indicating that residues 30, 33, 34, (AB-loop) and residues 124, 126, 127 (D helix, DE-loop) were more critical than the adjacent residues for recognition of receptor. In addition, a cassette mutagenesis library was generated by fully randomizing the sequence of the four positions 29, 31, 32 and 35 in AB-loop, and used to select phage-IFN variants with WISH-hased panning method. Three phage-IFN variants were isolated to possess more antiviral activity in the range of 4—16-fold than parental phage-IFN after IPTG-induced soluble expression. The results suggest that phage displayed phage-IFN α1c/86D variants with increased specific activity might be obta     

人α1/158Ⅴ型(α1c型)干扰素基因在大肠杆菌中的表达及其产物的初步纯化

采用DNA聚合酶链反应(PCR)技术,将本实验室从中国人胎肝细胞染色体DNA中发现和分离的IFN-α1/158V基因的原始克隆,改造成适于进行非融合蛋白原核表达的结构形式,并在大肠杆菌中获得高效表达。测得重组IFN-α1/158V的抗病毒活性为1.9×10~7单位/升菌液。随后又采用以单克隆抗体亲和层析为主的纯化流程对表达产物进行初步纯化,获得了在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现单一条带的纯化产物。     

重组人干扰素α1 b滴眼液稳定性的研究

重组人干扰素α 1b滴眼液放置不同温度和不同时间后,定期测定其效价、无菌试验、pH值和外观,在4℃条件下,24个月内pH、无菌试验、外观和0月一致,没有明显变化;生物学活性24个月没有降低;室温（18～25℃）放置12个月活性明显降低,pH、无菌试验、外观和0月一致;37℃放置6个月活性基本丧失,pH、无菌试验、外观和0月一致.重组人干扰素α1b滴眼液在4℃条件下生物活性及其他理化性质稳定性较好.     

人成熟干扰素αD基因表达质粒的组建与分析

本工作利用本组构建的含tac启动子(promoter)的载体pTL和人工合成的接头片段,组建了人成熟干扰素αD基因的表达质粒。先从p8218质粒中酶切分离出人干扰素αD基因的Sau3AⅠ-PstⅠ大片段(约780bp),再与人工合成接头EcoRⅠ-Sau3AⅠ(11bp)及pTL的EcoRⅠ-PstⅠ大片段载体混合,用T4DNA连接酶连接后,转化大肠杆菌MM294,用氨基苄基青霉素抗性作为筛选克隆的标志,所得质粒命名为pSBM_(22)。经酶谱分析和DNA顺序测定,证明pSBM_(22)中人工接头的连接是正确的,含有人成熟干扰素αD基因。经抗病毒活性检查,每立升大肠杆菌发酵液可获得约5×10~6NIH单位的干扰素。     

人αD型基因工程干扰素的研制在北京通过鉴定

由中国预防医学中心病毒学研究所和中国科学院上海生物化学研究所共同协作完成的国家科委重点攻关项目“人aD型基因工程干扰素的研制”,于2月12日在北京通过专家们的鉴定。 该研究首先建立了人白细胞干扰素高效诱生系统,从新城疫病毒诱生的人脐血白细胞中提取及纯化12S聚(A)RNA,经反转录后,建立了人白细胞干扰素基因无性繁殖系;经酶谱及部分DNA序列分析,证明所克隆的人干扰素基因属aD型。通过一系列的基因操作,使人aD型干扰素基因在原核细胞中获得高效     

人干扰素α1b突变体IFNα1b/31K的构建及其生物学评价

目的:构建干扰素α1b突变体IFNα1b/31K,以期获得高效低毒的新型药物分子。方法:根据合理药物设计,采用定点突变技术,将干扰素α1b第31位氨基酸残基突变为K,并构建表达IFNα1b/31K重组蛋白。纯化后,对其抗病毒活性、抗肿瘤细胞增殖活性和动物体内急性毒性进行考察。结果:IFNα1b/31K表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后的IFNα1b/31K纯度大于95%,比活性约为IFNα1b的1.7倍,抗肿瘤增殖活性比IFNα1b降低,未见对实验动物的急性毒性作用。结论:成功设计构建并表达了高效低毒的IFNα1b突变蛋白分子。     

定向进化人α型干扰素基因家族的研究

应用DNA改组(DNAshuffling)技术重组了12种人α型干扰素基因,并结合噬菌体表面呈现(phagedisplay)技术构建了噬菌体干扰素改组文库,采用简便的、功能性的定向竞争筛选方法,获得了比活达1 0×109IU/mg的新型α型基因工程复合干扰素,是目前国际上已投产的α2型干扰素的5倍,具有生产应用前景,上述策略也为其它细胞因子或酶的改造提供了借鉴方法。     

人干扰素α-2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术．不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序．以及大肠杆菌表达的人干扰索α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题．从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得l000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为l×10³u／mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

重组人干扰素α2b的制备研究

为了获得高活性高纯度的rh IFNα2b,对重组人干扰素α2b进行克隆、表达,并深入研究了其纯化工艺。采用重叠延伸PCR法合成了编码IFNα2b的基因,用DNA重组技术构建了原核表达载体p BV220-IFNα2b,获得了稳定的工程菌种。发酵产物通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过变性、复性、离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化,得到rh IFNα2b纯品,其比活可达1×10~8IU/mg。实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础。     

人干扰素α—2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术,不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序,以及大肠杆菌表达的人干扰素α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题,从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得1000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为1×10~8u/mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

纯化的重组人α1型干扰素的某些理化性质

经SDS-PAGE银染色分析表明,重组人α1型干扰素基因在大肠杆菌中的表达产物rHuIFN-α1分子中含有巯基,易形成分子聚合体。等电聚焦电泳(IEF)的银染色结果揭示了其多种等电点的分子形式。双向电泳证明,每种等电点的rHuIFN-α1都可形成自身的聚合体。初步讨论了rHuIFN-α1的分子聚合体和多种等电点体的形成原因。     

重组人干扰素α1b与新型冠状病毒肺炎防治

干扰素调节免疫具有广谱抗病毒和抗肿瘤作用。重组人干扰素α1b是国内自主产权的基因工程I类新药,通过多年研究,研制出儿童和成人应用的重组人干扰素α1b注射液、喷雾剂等多种剂型,完成治疗冠状病毒等肺炎的药理学、毒理学、药代动力学和相关临床研究,形成了多个临床应用的专家共识和指南性文件。新型冠状病毒肺炎疫情发生后,这些研究为国家卫健委将干扰素α雾化吸入作为首推抗病毒药物试用方案纳入《新型冠状病毒感染的肺炎国家诊疗方案》提供了基础。经过大量新冠肺炎患者的临床使用,取得了良好的治疗效果。重组人干扰素α1b喷雾剂作为可预防病毒感染的药物,用于医护人员等高暴露人群的生物防护,为疫情防控发挥了重要作用,将对国民健康和国家生物安全保障做出应有的贡献。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

将重组人干扰素α2b栓剂在不同温度下保存不同时间,检验干扰素生物活性、溶出度试验、融变时限、pH值和微生物限度及外观的稳定性。重组人干扰素α2b栓剂在4~8℃条件下放置48个月;在20~25℃条件下放置24个月IFN生物活性未见下降,37℃放置4个月IFN生物活性未见下降。重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质有较好的稳定性。