提高磷素利用率的工程化饲料

Mogen公司的研究人员培育出了一种可使鸡利用其饲料中更多磷素的植物。目前的状况是需向动物饲料中补加酶来提高消化能力和养份的利用。磷在作为动物饲料的植物种子中一般的贮藏形式为肌醇六磷酸(植酸)。这种贮存形式的磷在单胃动物中几乎不被利用。研究人员将黑曲霉的肌醇六磷酸酶加入猪和家禽饲料,该酶的低pH最适值使之可以在动物的胃肠道中行使功能。当向饲料中加入肌醇六磷酸酶时,大大提高了磷的利用率并减少了粪便中磷的排出。环境中含磷会引起地表水的富化作用。 由Jan Pen领导的Mogen公司的研究人员向转基因烟草中导入了曲霉的肌醇六磷酸酶基因。导入基     

高甲硫氨酸玉米杂种可使动物饲料不再需要添加剂

多年来,几家植物生物技术公司一直在尝试培育含大量甲硫氨酸(一种必需氨基酸)的玉米品种。现在Rutgers大学(Piscataway,NJ)的Joachim Messing已培育出一种新玉米,其甲硫氨酸含量为普通玉米的5倍。这一进展是朝着消除动物饲料对甲硫氨酸添加剂的需求的方向迈进的一大步。由于家畜本身不能制备甲硫氨酸,所以,作为饲料的玉米中通常要添加甲硫氨酸。Messing氏的玉米产品的甲硫氨酸含量已达到饲料要求标准的75％。该氏相信,进一步研究将使之达到100％,从而取消对甲硫氨酸添加剂的需求。 Messing是靠两次回交培育出新玉米的。在此过程中,他可能已克服了基因组印迹现象(细胞分裂时的一种过程,遗传信息被稳定在一种抑制或激发的状态下)。负责甲硫氨酸生产的基因已被克隆出来,但     

巴西橡胶树磷脂酰肌醇转移蛋白cDNA的克隆及其序列分析

本文从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)差减cDNA文库中筛选到一个与磷脂酰肌醇转移蛋白(phos-phatidylinositol transfer protein)同源性较高的基因片段,并根据该基因片段序列信息,设计特异性引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE(rapid amplification of cDNA ends)进行差异片段的5'和3'端的扩增,并获得长度为1081bp的全长cDNA克隆R291(GenBank登陆号:AY589690)。序列分析表明,该基因包含702bp的开放阅读框,编码234个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为26.8kD,等电点为6.51,有一个的跨膜螺旋区(氨基酸位点为83～103)。R291基因含有一个脂质结合保守区(Sec14p-like lipid-binding domain),具有CRAL-TRIO脂质结合结构域,推测该基因是一个磷脂酰肌醇转移蛋白基因。该基因的克隆将为橡胶树磷脂酰肌醇代谢的研究奠定了基础,将有助于进一步了解磷脂酰肌醇代谢与胶乳再生之间的关系。     

黑曲霉EIM-6 pelA基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆黑曲霉EIM-6果胶裂解酶A基因pelA,用于分析果胶裂解酶A的功能与结构。方法与结果:根据GenBank上黑曲霉pelA保守序列设计引物,采用RT-PCR获得黑曲霉EIM-6pelA基因;序列分析表明,pelA基因具有4个内含子,开放读框为1140 bp,编码379个氨基酸残基,含有由20个氨基酸残基构成的信号肽序列;生物信息学分析表明,果胶裂解酶A为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白,具有明显的跨膜结构域,β片层结构是该蛋白的主体结构,空间结构是由反平行的β片层结构为基础包围组成的大环,保守功能区域为Pec_lyase_C结构域。结论:克隆获得黑曲霉EIM-6pelA基因,并进行了生物信息学分析,为蛋白质工程改造果胶裂解酶A奠定了基础。     

在利用重组植物生产海藻糖方面联手

荷兰植物生物技术企业MOGEN公司和种苗企业D.J.van der Have公司上周签定共同开发合同,即用重组植物生产具有稳定物质特性的双糖海藻糖。目的是使用甜菜和马铃薯确立大量生产廉价海藻糖的技术。通过D.J.van derHave公司,两个公司还保证从芬兰Alko公司接受海藻糖专利许可的选择。两公司打算到1999年上市含植物海藻糖的产品。     

高温酸性磷酸酶acp基因的克隆、表达和功能的初步鉴定

从高温塘泥(温度在40～85℃之间)中分离到一组嗜热微生物,提取环境基因组DNA,通过随机测序,发现许多基因与Thermus属的DNA相似性很高,根据Genbank上Thermus thermophilusHB8基因组序列中推定的酸性磷酸酶基因(TTHA1616),设计引物,PCR扩增得到一段798bp的DNA序列,测序结果与Thermus thermophilusHB8基因组中酸性磷酸酶基因相似性达98%,含有完整的酸性磷酸酶保守区,于是将该基因在大肠杆菌中表达,得到一条约33KD的特异蛋白条带,酶活检测证实该推定蛋白具有酸性磷酸酶活力。     

一种充满商机的植酸酶

植酸酶（ｐｈｙｔａｓｅ）是酶制剂工业为重要成员,作为一种饲用酶制剂（新型饲料添加剂）,如果在饲料中添加植酸酶不仅提高饲料磷酸盐吸收率,而且减少家畜、家禽粪便磷酸盐的含量,同时大大减轻环境污染。因此开发植酸酶产品在国内外引起高度重视,美国、芬兰一些公司与英国的公司合作开发的植酸酶已商品化。中国农业科学院饲料研究所姚斌博士研究组与该院生物技术研究中心范云六院土研究组经多年的合作研究,率先在我国通过基因工程技术建构成一种“工程毕赤酵母”（Ｒｃｈｉａｐｏｔｏｒｉｓ）,高效表达植酸酶产物,经小试扩大到中试…     

黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达

【目的】实现在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)h408阿魏酸酯酶A基因(AnfaeA),并对重组酶特性进行表征。【方法】采用重叠延伸PCR扩增黑曲霉h408的阿魏酸酯酶A基因。将AnfaeA基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,成功构建重组质粒pPIC9K-Anfae,经线性化后电转化P.pastoris GS115,透明圈法筛选活性高的转化子后进行诱导表达。利用紫外吸收法测定温度及pH对重组阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】成功从A.niger h408中克隆得到阿魏酸酯酶A的cDNA基因(GenBank:KF911349),并实现了其在P.pastoris GS115中的高效表达。该基因长度为783bp,含有1个开放阅读框架(ORF),编码260个氨基酸,Blast分析显示该基因和GenBank中黑曲霉阿魏酸酯酶序列同源性为99%。翻译的氨基酸序列含有脂酶典型的活性盖子和催化三联体结构。从转化板上获得1株编号为pPIC9K-Anfae5的转化子阿魏酸酯酶活性最高,酶活达24.72 U/mL,比活力为40.84 U/mg,比黑曲霉出发菌株(22.1 mU/mL)提高了1100倍左右。重组阿魏酸酯酶的最适pH为5.0,且在pH 4.0-9.0稳定性较好;最适反应温度50℃,在40-60℃时较稳定。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的高效分泌表达为其在饲料工业和造纸工业等工业化应用提供了前提,也为后续改进酶学特性的定向进化奠定实验基础。     

加拿大Alta Genetics公司的核移植卵技术

协同饲料通过日本商社就加拿大Alta Genetics公司的克隆卵(核移植卵)培养技术和受精卵的性别鉴定技术引进,与加拿大公司开始谈判.协同饲料研究所所长草彅登夫说,“用自己公司研究积累的经验也能掌握这些技术.但是自己干还是引进,在公司内部还没有结论. 该公司1989年确立未受精卵的完全体外培养系,同年在北海道的带广与中札村役场、农协、十胜家畜共济、带广畜产大学合作进行体外冷冻受精卵移植的现场试验.该公司通过家畜改良事业团从而获得芝浦屠宰场家畜卵巢.     

大肠杆菌植酸酶基因appA的克隆与高效表达

从猪粪便中分离并筛选出高效生产酸性植酸酶和磷酸酶双功酶(appA植酸酶)的大肠杆菌菌株。通过PCR方法从该菌株基因组中扩增获得了植酸酶基因appA,测序结果显示该基因编码区全长1,299个核苷酸。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a( )上,通过转化的大肠杆菌BL21在试管摇床培养条件下得到了高效表达,其表达量达到692U／mL。酶学特性分析表明其反应的最适pH为4．5,最适温度为60℃。     

代谢工程改造黑曲霉生产葡萄糖二酸

葡萄糖二酸是葡萄糖的一种二元羧酸衍生物,是重要的平台化合物,被应用于医药、化工等领域。本研究以黑曲霉为底盘细胞,通过表达来自恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440的糖醛酸脱氢酶基因ppudh,成功在黑曲霉中实现了葡萄糖二酸的合成,产量为18.74 mg/L;在此基础上通过共过表达黑曲霉自身来源的肌醇加氧酶(anmioxA)和肌醇-1-磷酸合酶(aninoA)、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的羧酸转运蛋白(scJEN1),强化了合成通路和外泌途径,将产量提高至102.10 mg/L;通过表达来自乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363的NADH氧化酶(llnox),建立NAD⁺辅因子循环系统,使产量进一步提高至115.65 mg/L;利用RNA干扰技术对竞争支路中的关键酶磷酸果糖激酶(pfkA)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)进行弱化表达,葡萄糖二酸最终的产量达到313.65 mg/L。本研究为微生物高效生产葡萄糖二酸和下游相关产品生产奠定基础。     

克隆红色色素的生物合成基因群

麒鳞啤酒公司与海洋生物技术研究所合作从海洋细菌中首次克隆了类胡萝卜素红色色素虾青素的生物合成基因群。另外,在世界上首次在基因水平上阐明了虾青素生物合成过程包括2个过程。 虾青素是鲷和虾等动物中存在的类胡萝卜素系色素,色调鲜艳,有对光和热、pH的稳定性。最引人注目的用途是作食用色素,饲料添加剂等。它还具有比β-胡萝卜素还高的抗氧化能力。麒麟啤酒公司将虾青素生物合成基因群插入酵母,开发水产用饲料,即用这种饲料养殖虾、鲷鱼。与现有的配合了从磷虾属、     

小菜蛾碱性磷酸酶基因cDNA片段的克隆及其序列分析

利用DNAman设计简并引物,通过反转录一多聚酶链式反应(RT-PCR)克隆小菜蛾Plutella xylostella(L.)抗性、敏感种群中可能与苏云金芽孢杆菌(Bt)抗性相关的碱性磷酸酶基因。琼脂糖电泳结果显示扩增条带与预期片段长度一致,阳性克隆经测序获得了403bp的基因片断。经blast比较得出所克隆基因属于碱性磷酸酶基因。与敏感种群相比,抗性种群中该基因片段有18个碱基发生变化,有1个氨基酸发生替换(缬氨酸转变为苏氨酸)。研究结果对于进一步研究小菜蛾全基因结构、功能有重要的意义。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

文摘

010 0 93人可溶性肿瘤坏死因子受体Ｉ型基因在黑曲霉中的表达[中 ]/李敏… / /科学通报 .- 2 0 0 1,4 6( 1) .- 5 7～ 60将人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型 (ｓＴＮＦＲＩ)基因插入黑曲霉 (Ａ .ｎｉｇｅｒ)融合蛋白基因的表达质粒 ｐＩＧＦ中 ,融合之处设计类胰蛋白酶 (ＫＥＸ2 )加工位点 ,构建融合表达载体ｐＨＢＣ。以 ｐＨＢＣ转化黑曲霉胞外蛋白酶缺失株Ａ .ｎｉｇｅｒ3 .795 - 1- 2 3 ,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性克隆Ａ .ｎｉｇｅｒ3 .795 - 1- 2 3重组菌株的蛋白电泳显示有特异表达带 ,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ证实该分泌…     

代谢工程改造酿酒酵母合成肌醇

【目的】肌醇别名环己六醇,是一种具有生物活性的糖醇,在医药、食品和饲料等领域具有重要的应用价值。为获得生产肌醇的微生物细胞工厂,通过代谢工程改造,构建生产肌醇的酿酒酵母工程菌株。【方法】对酿酒酵母肌醇合成途径的正负调控同时改造,过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1,敲除肌醇生物合成的转录抑制子基因opi1和抗性基因kan MX,获得重组菌。利用气相色谱法检测重组菌发酵液中肌醇含量。【结果】构建了生物安全性的产肌醇基因工程菌株,摇瓶培养产量为1.021 g/L。【结论】通过过表达ino1和敲除opi1来改造酿酒酵母,能够有效提高重组菌的肌醇产量,为下一步的微生物发酵法产肌醇的工业应用奠定基础。     

黑曲霉C112纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析

以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉C112菌株为模板,采用RT-PCR技术克隆黑曲霉C112的纤维二糖酶基因bgl(Gen Bank登录号:KP307454);该基因全长2 934 bp,含有非编码序列,编码860个氨基酸,等电点为4.70,核酸序列与数据库的Aspergillus niger(Gen Bank登录号JX982101.1)同源性达到了99%;生物信息学分析表明,纤维二糖酶为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白;二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件;该基因经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明,重组表达产物的相对分子量约为93.3 k D,与预期相符;纤维二糖酶在大肠杆菌BL21中胞内融合表达,重组蛋白p NPG酶活为5.847U/m L,最适反应温度为50℃,最适p H值为5.0。     

转植酸酶基因玉米的研究与安全评价

植酸酶是应用最广泛的饲料添加剂之一,它在自然界中广泛存在,能提高饲料中磷的利用率,对减轻动物高磷粪便导致的环境水域污染有着重要意义.玉米是动物饲料的主要原料,在玉米饲料中添加植酸酶易造成饲料成本升高和生产效率降低等问题.近年来随着基因工程技术的发展,已克隆出多个真菌植酸酶基因,并成功在微生物、植物系统中表达.本文主要介绍了植酸酶基因的微生物来源与相关研究成果,阐述了转基因技术的常用方法和转植酸酶基因玉米的研究进展,并详细评价了转植酸酶基因玉米的安全性.通过对转植酸酶基因玉米的深入探讨,对改善玉米的品质,降低成本及推广植酸酶在饲料工业中的应用具有重要意义.