酵母糖基化改造工程研究进展

酵母真核表达系统是常用的安全性较高的外源蛋白表达系统。酵母细胞内存在翻译后糖基化修饰过程,对其糖基化修饰系统进行改造可用于生产人源糖蛋白。研究表明,可以通过基因工程手段消除酵母特有的内源糖基化反应、引入哺乳动物细胞表达系统中糖基化类型等方法对酵母糖基化路径进行改造。近年来许多研究通过对酵母菌株糖基化位点突变、基因缺失等方法对酵母糖基化系统进行改造,探究糖基化修饰对蛋白质功能的影响,这为利用酵母生产治疗性蛋白和新型糖基化疫苗提供了新的思路。本综述将对近年来酵母糖基化改造成果及研究进展进行综述。     

真菌N-糖基化系统在异源表达中的研究进展

在近20年来,越来越多的真菌被开发成异源蛋白表达宿主,用来生产各种药用蛋白和酶类。随着对真菌异源表达系统的研究,人们也渐渐意识到真菌N-糖基化系统与高等动物的N-糖基化系统有着明显的区别,这也成为真菌生产高等动物源性糖蛋白的一个技术瓶颈。本文综述了真菌在异源表达糖蛋白工程中其N-糖基化系统的研究进展。包括N-糖基的检测技术和改造策略,并重点介绍了真菌N-糖基化系统与高等动物的N-糖基化系统的差异,以期为日后真菌N-糖基化系统动物源化甚至人源化改造提供参考。     

酵母表达人源化糖蛋白研究进展

与人体天然复杂型糖蛋白相比,使用酵母生产的药用蛋白带有高甘露糖型N-糖链。这一差异在临床应用中产生了许多不良影响。目前,可以通过消除酵母特有的内源糖基化反应,引入哺乳动物细胞中的一系列糖基转移酶及转运蛋白对酵母糖基化路径进行改造,从而使其表达出人源化的复杂型N-聚糖。本文介绍了酵母N-糖基化特点、糖基化不均一性,综述了近年来利用基因工程改造酵母N-糖基化路径获得特定的人源N-连接糖蛋白以及使用内切糖苷酶生产人源糖蛋白的研究进展,并且对存在的问题及今后的发展前景进行了讨论。     

α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株构建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF 表达的研究

酵母对蛋白的糖基化修饰过程不同于哺乳动物,其特点为产生高甘露糖型糖基且易发生过度糖基化。本研究通过两步基因重组敲除目标基因的方法成功敲除了毕赤酵母中的α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)基因,获得了och1敲除的菌株。以此为基础,构建了高效表达人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(HSA/GM-CSF)的工程酵母,与野生型毕赤酵母表达的过度糖基化HSA/GM-CSF不同,och1敲除菌表达的该融合蛋白糖基化程度明显降低,这为该融合蛋白的开发提供了重要基础。och1敲除菌株的构建不仅提供了一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,而且为进一步的酵母糖基工程改造提供了基础。     

酵母N-糖基化工程研究进展

酵母表达系统可用来生产具生物活性的重组糖蛋白,但其在N-糖基化过程中会生成高甘露糖型糖链。通过引入相关的甘露糖苷酶和糖基转移酶基因、切断酵母自身的高甘露糖链形成通道能够改变酵母宿主N-糖基化的类型。本对酵母N-糖基化工程的研究状况、最新进展及存在问题作简要阐述。     

酵母O-甘露糖转移酶的研究进展

随着糖蛋白类药物的需求量不断增加,酵母表达系统的人源化改造成为当务之急。其中,酵母蛋白的O-糖基化因O-糖链种类繁多、组分单一以及糖基化位点预测困难等因素,限制了酵母蛋白的O-糖基化人源化改造。从酵母蛋白的O-糖链结构、O-糖链发生过程及O-糖链的功能展开综述,重点介绍起始酵母蛋白O-糖基化过程的O-甘露糖转移酶家族(family of protein O-mannosyltransferases, PMTs)成员的研究现状,希望对酵母蛋白O-糖基化人源化改造研究提供参考。     

蛋白质药物糖基化工程化改造研究进展

多种哺乳和非哺乳动物的蛋白质表达系统已成功用于重组糖蛋白药物的生产。糖基化对于生物药品的研究开发至关重要,对生物药品的药效、半衰期及抗原性等产生重要影响。糖基化工程的目的是生产组分明晰、结构均一的N-和O-连接的糖基化蛋白药物。N-糖基化改造的相关研究显示,利用哺乳动物和非哺乳动物表达系统可以表达均匀的N-聚糖重组糖蛋白。与N-糖基化改造相比, O-糖基化的改造研究尚处于起步阶段。首个糖基化工程单克隆抗体已在美国和日本获得上市批准。综述了重组蛋白表达系统的糖基化工程化改造的研究进展,包括蛋白质药物的 N-糖基化改造和O-糖基化改造的最新进展,以期为蛋白质药物的糖基化工程改造研究提供参考。     

Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建

蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01 (ura3、och1) 的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I (MDSI) 的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE (基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳) 分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF (人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白) 的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶 (MnsI) 基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。     

毕赤酵母蛋白质糖基化途径的改造

【背景】以酵母为宿主生产的蛋白往往发生过糖基化,形成高甘露糖型的N-糖基化。高甘露糖型的结构易在人体中引起免疫反应,这是酵母不能用于绝大部分糖蛋白药物生产的主要限制因素。因此,构建表达人源糖基化糖蛋白的酵母底盘细胞将为糖蛋白药物的生产提供强有力的工具。库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)具有极强的抗逆性且生长迅速,是一种近年来备受关注的非典型性酵母,对其进行糖基化途径的改造将具有巨大的应用前景。【目的】对酵母N-糖基化途径的改造,首先要使其N-糖基化转变为Man₅GlcNAc₂核心结构,本研究对P. kudriavzevii的och1基因进行敲除并引入源自曲霉的msd S基因,以改变其分泌糖蛋白N-糖链的糖型结构。【方法】通过基因编辑对P. kudriavzevii的N-糖基化途径进行改造,获得P. kudriavzeviiΔura3Δoch1::msd S菌株,分析P. kudriavzeviiΔura3Δoch1::msd S菌株分泌糖蛋白上N-糖组的变化。【结果】与野生型P. kudriavzevii相...     

甲醇营养型酵母表达外源蛋白的特点及策略

酵母作为一类外源基因的表达系统具有很多优点。它们属于单细胞生物,因而保留了细菌易于操作和生长快速的特点;另一方面,酵母具真核生物的亚细胞结构,故具有糖基化,脂肪酸化,蛋白质磷酸化等翻译后修饰功能。大部分重组蛋白的表达都是以酿酒酵母（Xic’,bar．oopcescerevisiae）作为宿主系统的,它的遗传背景及生理特性研究得较透彻。然而,Scerevl’siae表达重组蛋白有其局限性：如产量通常很低,自我复制表达型载体在细胞传代中不稳定,外源糖蛋白的过糖基化作用等。近年来,随着研究的深人,人们用其它的酵母菌株构建了高效稳定的…