两株致病性哈维氏弧菌胞外产物的特性分析

采用硫酸铵分级盐析从哈维氏弧菌EcGY020401株和SpGY020601株培养物中提取其胞外产物,并对胞外产物的一些特性进行了分析。结果表明,两株哈维氏弧菌的胞外产物均具有较强的毒力,对鲫鱼的半致死剂量LD50为7.1g蛋白/g鱼体重;均具有淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性,而无脲酶和明胶酶活性;除EcGY020401株胞外产物对斜带石斑(Epinephelus coioides)红细胞有较强溶血作用外,对小鼠、鲫、人O型血等红细胞的溶血性都较弱或无;对草鱼吻端成纤维细胞(PSF)都具有细胞毒性。此外,经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析和离子交换柱层析,对Sp-GY020601株的胞外产物中蛋白酶进行了初步提纯,SDS-PAGE分析得一分子量约为38Kda的蛋白酶,该蛋白酶对鲫鱼有致死毒性,半致死剂量为3.3g蛋白/g鱼体重。     

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的表型克隆与序列分析

哈维氏弧菌是引起大黄鱼疾病的主要致病菌之一,胞外蛋白酶是哈维氏弧菌GYC1108-1的主要致病因子。利用表型克隆技术,用Sau3AⅠ将提取的哈维氏弧菌基因组DNA酶切成短片段,纯化回收1-5 kb的片段与BamH I酶切的pUC118在T4连接酶的作用下进行连接,并转化感受态细胞TG1,在含0.5%脱脂奶和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选胞外蛋白酶阳性株,命名为YZ。测定阳性株YZ的胞外蛋白酶活性,并对阳性株的重组质粒的插入片段进行序列测定,分析开放阅读框,确定胞外蛋白酶基因编码区。发现蛋白酶基因的ORF编码531个氨基酸,在起始密码子ATG上游存在一个核糖体结合位点(SD),其上游的启动区与大肠杆菌的σ70启动区和枯草芽孢杆菌的启动区高度同源。在终止子(TAG)下游,存在两个反向重复序列,为推导的2个转录终止子。哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆与诠释为哈维氏弧菌致病机理和疫苗的开发奠定了基础。     

哈氏弧菌EcGY020401优化培养

目的:为规模化制备弧菌疫苗提供相关数据.方法:利用摇瓶和小型发酵罐培养,通过平板计数测定培养菌液的活菌数.结果:哈氏弧菌(Vibrio harveyi)EcGY020401株最适盐度为20～25g/L,合适的pH为7.5～7.7,葡萄糖浓度最适浓度为2～5g/L,用TSB优化培养基:胰蛋白胨5g/L、蛋白胨15g/L、大豆蛋白胨3g/L、酵母膏1g/L、葡萄糖4g/L、磷酸氢二钾5g/L、氯化钠15g/L、pH 7.5,培养EcGY020401菌株,可达2.95×1010 cfu/mL;小型发酵罐培养,10h可达到生长最大值,菌液浓度为3.46×1010cfu/mL 结论:用优化TSB培养基,采用发酵罐培养弧菌,可降低成本,提搞培养效率.     

温度对溶藻弧菌HY9901株致病性相关蛋白的调控

将溶藻弧菌HY9901株置于15℃、20℃、28℃、37℃四个温度下培养,18h时分别测定细菌含量,胞外蛋白酶（Extracelluar protease, ECPase）表达量以及胞外产物（Extracellular product, ECP）对动物的致死性。结果表明,随着温度升高, 菌液浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率先升高后下降。28℃培养的细菌浓度、ECPase的活性以及ECP对小鼠和红笛鲷的致死率均为最大。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析不同温度培养下细菌的ECP和外膜蛋白(Outer membrane protein, OMP),结果显示,不同温度培养的溶藻弧菌ECP和OMP电泳图谱不同。溶藻弧菌主要ECP的分子量为70kD和62kD。ECP 70kD在20℃时的表达量最大,而28℃时ECP 62 kD的蛋白浓度最高。45kD OMP随着温度升高,其合成量增大,28℃时达最大值;而40kD和34kD OMP则随着温度的升高而减弱。通过研究电泳纯化的ECP 62kD和ECP 70kD的酶活性和致死试验,证明ECP 62kD具有很强的酶活性和毒性, 而ECP 70kD仅具有弱的酶活性和毒性。     

凡纳滨对虾细菌性病原的分离鉴定和耐药性研究

从5批患病的凡纳滨对虾分离细菌性病原,共分离纯化了50株细菌,随机选择形态差异的11株进行16S rDNA基因测序。测序结果表明,这11株菌主要分布在节杆菌属、弧菌属、芽胞杆菌属、微小杆菌属和希瓦氏菌属。对其中2株弧菌进行16S rDNA基因系统进化树分析,发现1株A1-1可能为Vibrio parahaemolyticus(副溶血性弧菌),而另外1株菌A2-3可能为Vibrio rotiferianus(半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌)。形态和生理生化鉴定表明A1-1符合副溶血性弧菌的基本特征,可能是副溶血性弧菌中的一个型。人工感染实验表明A1-1对金鲫鱼具有明显的致病性,1×10~6 CFU感染剂量时能使80%金鲫鱼死亡。耐药性分析表明A1-1对土霉素、红霉素有较强的抗药性,而对链霉素、新霉素、四环素和氟本尼考均表现一定的敏感性。     

鱼源溶藻弧菌胞外产物的特性研究

溶藻弧菌经胰胨大豆胨琼脂培养基(TSA 2%NaCl)培养48h后,培养物用PBS洗脱、离心,再经孔径0.22μm微孔滤膜过滤,制得胞外产物(Extracellular product,ECP)。经检测,该ECP具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等4种酶活性,其中淀粉酶的活性最高,酪蛋白酶、脂肪酶活性次之,卵磷脂酶活性较低,未检测出明胶酶及脲酶活性;能溶解断斑石鲈(Pomadasys hasta)、眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)和赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的红细胞,而不能溶解鸡、羊及O型人红细胞;对小白鼠和石斑鱼的LD50分别为0.08mg/g和0.17mg/g,95%可信限分别为0.06—0.12mg/g和0.07—0.28mg/g;50mmol/L EDTA和100mmol/L苯甲基磺酰氟能使胞外蛋白酶(Extracellular pro-teinase,ECPase)的活性分别下降83.40%和51.32%;ECPase对热稳定性较差,碱性条件下活性较高,其最适温度为50℃,最适pH为8.0。     

拟态弧菌金属蛋白酶基因PrtV缺失株的构建及生物学特性分析

【背景】研究发现PrtV基因编码含多囊肾病(polycystic kidney disease)结构域的金属蛋白酶,其在多种细菌的致病过程中具有重要作用。拟态弧菌是一种感染多种水生动物的重要病原菌,PrtV基因在拟态弧菌致病中的作用尚不清楚。【目的】探究PrtV基因对拟态弧菌致病相关生物学特性的影响。【方法】采用自然转化的方法构建拟态弧菌PrtV基因缺失株(ΔPrtV),同时通过基因与质粒重组后电转化导入缺失株构建回补株(ΔPrtV/pPrtV),对突变株的生长特性、生化特征、生物被膜形成、自聚集能力、胞外产物卵磷脂酶和蛋白酶活性,以及致病性和细胞毒性等进行分析。【结果】与野生株相比,缺失株的生长特性、生物被膜形成、自聚集能力和卵磷脂酶活性无变化,但分解尿素、甘氨酸、香豆酸盐、鸟氨酸和赖氨酸的理化特性改变;胞外产物蛋白酶活性显著降低(P<0.05),细胞毒性显著下降(P<0.05),对杂交鲇的致病力下降10倍。【结论】PrtV基因与拟态弧菌的细胞毒性及致病性等多种生物学特性有关。该结果为进一步解析拟态弧菌PrtV基因功能及其致病机制提供了依据。     

徐闻方斑东风螺暴发性疾病病原分离鉴定以及防治手段探索

为了明确引起方斑东风螺急性死亡症的病原,对2015年6月广东省徐闻县发生的方斑东风螺(Babylonia areolata)急性死亡症进行了病原分离纯化,获得1株优势细菌,命名为XW-01。将XW-01人工感染方斑东风螺,表现出自然发病症状,证实分离菌株为致病菌。分离的菌株经形态学观察、生理生化鉴定和病原16S r RNA序列分析,结果显示该病原菌为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。XW-01对方斑东风螺半致死剂量(LD50)测定值为6.3×106 cfu/m L。药敏试验结果显示,该病原菌对常见的7种抗菌药物氟哌酸、氟苯尼考、氨苄西林、恩诺沙星、头孢三嗪、左旋氧氟沙星和妥布霉素敏感。添加不同剂量的三联生物噬菌王产品到水族箱中,对方斑东风螺用浸泡法进行人工感染哈维氏弧菌试验,观察东风螺发病及死亡情况。试验结果表明,添加1%的此产品可以明显降低东风螺的死亡率,表明三联生物噬菌王产品对东风螺感染哈维氏弧菌所引起的急性坏死病有明显的预防作用。     

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆表达及免疫原性

根据实验室分离的大黄鱼弧菌病主要病原菌哈维氏弧菌(Vib rio harveyi)GYC1108-1株的胞外蛋白酶基因序列,设计胞外蛋白酶基因(ΔProA)特异性引物,扩增获得1552bp的ΔProA基因,克隆于pUC57-T载体;将ΔProA基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,ΔProA融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,分子量大小约55kD,诱导5h的表达蛋白产量约占细菌总蛋白的21%。Western blot分析,表达的55kD蛋白具有较高免疫原性。用纯化的ΔProA融合蛋白对大黄鱼进行免疫试验,结果免疫保护率达到75%。       

恩诺沙星对4种水产致病弧菌的抑杀菌效应

采用二倍稀释法测定恩诺沙星对溶藻弧菌、最小弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌4种12株菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明:恩诺沙星对12株弧菌的MIC为0.1?0.8 mg/L,MBC为0.4?3.2 mg/L。在此基础上,从每种菌中选取一株对恩诺沙星较为敏感的菌株,研究恩诺沙星不同药物浓度(1 MIC、2 MIC、4 MIC)对4种弧菌的杀菌动力学和抗菌后效应(PAE),结果显示:各浓度恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R菌株均有较强的杀菌作用,而对哈维氏弧菌M071202-H、创伤弧菌Q050723-C、最小弧菌H010911-Z等3菌株却表现出了低浓度抑菌、高浓度缓慢杀菌的作用。恩诺沙星的抗菌后效应PAE与药物浓度及细菌与药物的接触时间成正相关,恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R的PAE最长,对哈维氏弧菌M071202-H的PAE最短。     

沙门菌CWDMs脂代谢检测

采用毛地黄皂苷敏感试验和菌细胞胆固醇、甘油三脂及胆碱酯酶定性与定量分析法,检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌经L 型变异后形成的细胞壁缺陷突变株(CW DM )的脂类代谢活性,了解这些CW DM 变异的性质和探讨细菌细胞壁缺陷突变与细菌演变的关系。结果表明,沙门菌CW DM s 具有显著的胆固醇和甘油三脂代谢活性、对毛地黄皂苷高度敏感并且还具有与白色念珠菌相似的胆固醇和甘油三脂的含量,但未能检出胆碱酯酶活性。CW DM s返祖菌丧失了脂类代谢酶类和胞浆膜不含胆固醇,恢复了与其亲代细菌型相似的代谢特征。提示在沙门菌天然即存在有与脂类及胆固醇代谢相关的基因,细胞壁的缺陷导致这些脂类及胆固醇代谢基因活化,以致 CW DM s 能够表达固醇和甘油三脂代谢活性和胞浆膜含有胆固醇     

沙门菌CWDMs氨基酸代谢的检测

采用氨基氨利用生长试验和谷丙转氨酶（ＧＰＴ）、谷草转酶（ＧＯＴ）、乳酸脱氨酶（ＬＤＨ）、肌酸激酶（ＣＫ）、α－闳丁酸脱氢酶（α－ＨＢＤ）、γ－谷志肽酶（γ－ＧＴ）,酸性磷酸酶（ＡＣＰ）定性与定量分析法,检测伤ＣＷＤＭｓ变异的特点及其机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ在仅含蛋氨酸或脯氨     

沙门菌CWDMs乳酸脱氢酶同功酶的观察

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的ＣＷＤＭｓ及其宁代细菌型和伤寒杆菌粗糙型的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同功酶,以了解沙门菌ＣＷＤＭｓ生物氧化的特点和机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质。结果表明,伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的细菌型及伤寒杆粗糙型在聚丙烯酰胺凝胶电泳后显示出相同的４种具有不同泳动速率的ＬＤＨ同功酶,但ＣＷＤＭｓ仅显示２种ＬＤＨ。ＣＷＤＭｓ的２种ＬＤＨ同功酶与其亲代细菌型及伤寒杆     

光照对蕨类植物配子体假根向重力性的影响

对８种蕨类植物配子体假根向重力性反应的研究结果表明,除卷柏Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｔａｍａｒｉｓｃｉｎａ Ｓｐｒｉｎｇ配子体假根无向重力性反应并且其生长方向与光照方向无关外,其它７种的配子体假根均有向重力性反应,并且假根的向重力性反应在配子体发育初期,因光照的方向不同而异,表现为负向光性。随着配子体发育至片状体阶段,光对其向重力性反应的影响逐渐减弱,而重力的影响增强。在蕨类植物配子体发育初期,光对     

中国鳐类脑颅的研究

作者解剖观察了33种,隶于4目、7亚目、15科、19属的中国鳐类脑颅的形态。研究结果认为:锯鳐目和鳐目是原始类群,它们均具吻软骨,其中圆犂头鳐科和团扇鳐科是特化类群。电鳐目亦具吻软骨,它们是特化和退化类群。在较高等的鲼目则无吻软骨。依据鳐类不同的分类阶元,其脑颅亦各具有不同的式型。     

两种蚤的幼虫形态

关于蚤类幼虫形态的研究,进展比较缓慢,我国王敦清1956年首次描述7种蚤的幼虫形态以后,由柳支英,虞以新(1957),孙昌秀(1965),叶瑞玉(1982,1986),费荣中(1986)等学者先后共描述过约29种蚤的幼虫形态。到目前为止,我国已知蚤类幼虫形态约36种,隶属6科19属。本文描述未见报道的无棘鬃额蚤Frontopsylla aspiniformis Liu etWu(1960)和青海双蚤Amphipsylla qinghaiensis Ren et Ji(1979)两种蚤山幼虫形态。     

省沽油科叶解剖结构的分类学意义

本文对国产省沽油科 Staphyleaceae 4属植物叶的解剖结构进行了详细的比较研究。结果表明, 叶解剖结构特征在属间的区别较明显, 特别是瘿椒树属 Tapiscia 有着几乎与其他三属截然不同的独特性状。根据已有的孢粉学, 花、节及木材的解剖等方面的资料, 我们支持Тахтаджян(1987)将瘿椒树亚科分出而建立瘿椒树科 Tapisciaceae 的观点。瘿椒树属为我国特有属, 根据我们对采自不同产地的材料观察, 居群间的差异很小, 其可能仍为一单种属。     

沙门菌CWDMs苹果酸脱氢酶的检测

目的：了解沙门菌细菌壁缺陷突变株（CWDMs）的生物氧化及遗传特点和探讨细菌壁缺陷变异的性质与机制。方法：采用PAGE电泳法和分光光度法检测伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌及其CWDMs和伤寒沙门菌粗糙型和苹果酸脱氢酶（MDH）同工酶的活性与类型。结果：伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的细菌型和伤寒沙门菌粗糙型经PAGE电泳可见一条MDH同工酶带,CWDMs电泳后可见两条MDH同Ⅰ酶带,在CWDMs的MDH中有一条泳动速率与细菌型及粗糙型的相同,另一条则较快。分光光度法检测证实。细菌型与粗糙型的MDH活性相似,CWDMs的MDH活性则明显较低。结论：CWDMs保留了与亲代细菌型一致的MDH和形成了一种新的MDH,并且其MDH的活性已显著降低,此特性可能与CWDMs生物氧化特性的改变有关。