酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达

利用PCR技术从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae W303-1A）总DNA中扩增得到1．9kb乙醛脱氢酶编码基因aldh,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac—aldh,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。对含有aldh的基因工程菌进行表达研究表明：该菌株在37℃下,以1．0mmol／LIPTG诱导5h酶活力达到22．8U,比酶活力为15．0U／mg蛋白,而对照菌株检测不到酶活力,并且该菌的耐乙醛浓度可达3．2g／L。     

大肠埃希菌trp operon的克隆与表达

色氨酸操纵子所表达酶的高效表达和酶活性的提高,从而构建高产色氨酸菌株.利用PCR的方法从大肠埃希菌基因组中直接克隆色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pBV220-trp operon,转化大肠埃希菌DH5α,温度诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性.通过凝胶电泳观察PCR扩增产物大小约为7 kb.SDS-PAGE鉴定目的蛋白得到了高效表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.4倍和2.5倍.成功构建了重组质粒pBV220-trp operon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠埃希菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础.     

利用重组钝齿棒杆菌高效合成L-茶氨酸

【目的】构建Bacillus subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶蛋白(GGT)的Corynebacterium glutamicum SYPA5-5表达系统,验证该蛋白信号肽片段在宿主表达体系中的作用,并将该体系应用于高效合成茶氨酸的研究。【方法】将该ggt基因和切除信号肽的片段基因(?sp ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中克隆表达。以C.glutamicum SYPA5-5高产L-精氨酸培养基为基础进行重组菌产酶优化。最优转化条件为:L-谷氨酰胺∶乙胺为1∶3,酶量为0.06 U/mL。采用底物流加策略高产L-茶氨酸,40 mL的转化体系包含:终浓度为0.9 U/mL的GGT,pH 10,37℃,从0 h开始每隔2 h补加20 mmol/L的L-谷氨酰胺,60 mmol/L的乙胺。【结果】C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-ggt发酵上清液中GGT酶活达到(4.69±0.34)U/mL,C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-?sp ggt只检测到胞内酶活(0.99±0.17)U/mL,说明利用B.subtilis来源的信号肽可以实现GGT在C.glutamicum体系中分泌表达。最适产酶培养基条件为:葡萄糖浓度为10%;IPTG最适添加时间为0 h。批次流加在12 h时达到最大茶氨酸产量104.36 mmol/L,转化率为86.9%。【讨论】本文首次实现B.subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶基因(ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中分泌表达,通过分批流加底物获得目前报道的利用重组C.glutamicum合成L-茶氨酸的最高产量。     

白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

构建了白地霉脂肪酶Ⅰ的基因工程菌,为进一步进行蛋白质工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。从新疆昌吉市油脂化工厂含油冻土中分离得到1株低温脂肪酶产生菌-白地霉ch-3。该菌发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃仍可保持66%的相对酶活力。应用PCR技术从白地霉ch-3基因组DNA中克隆得到脂肪酶Ⅰ基因lip1,将该基因与原核表达质粒载体pET-22b（＋）连接,构建重组质粒pETl-ip1,转化E.coliBL21（DE3）,酶切鉴定,筛选得到重组菌。十二烷基磺酸钠-聚丙希酰胺（SDS-PAGE）显示重组脂肪酶Ⅰ的相对分子质量约为5.8×10^4,酶活为2.73 U/mL,表明lip1基因的表达产物具有正常的生物学活性。白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因lip1能够在大肠杆菌中有效地表达。     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基,终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此,重新设计和合成了PCR引物,并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．     

采用pHsh载体克隆与表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因

利用质粒pHsh为表达载体,构建高效表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因工程菌E.coli DH10B/argE-pHsh.为提高酶活并降低生产成本,优化了诱导条件.结果表明:NAOase可在pHsh系统中高活性表达,诱导起始OD600为0.6,在空气摇床中42℃热激诱导5h重组菌比酶活达到152U/mL.     

丁酸梭菌1，3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的克隆及在大肠杆菌中的表达

以丁酸梭菌（Clostridium butyricum）基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT,将它连接到pMD18一T载体上,得到重组质粒pMD—dhaT,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,dhaT基因全长为1 158bp。将dhaT基因插入表达载体pSE-380中,构建成重组子pSE—dhaT,并在大肠杆菌JMl09中进行诱导表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在37℃下,以1．0mmol／L IPTG诱导14h,酶活力达到16．28U／mL,比原始菌株提高5、6倍。     

青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

以获得大量胞外青霉素酶为目的,将青霉素酶基因克隆至表达载体pWB980中,并转化到双蛋白酶缺陷的Bacillus subtilis DB104。重组菌在LB培养基中培养24小时后, SDS-PAGE分析发现目的蛋白分子量为28kDa,酶活力为339U/mL;通过筛选7种不同的发酵培养基发现4#培养基更利于青霉素酶的表达,最大酶活力为1580U/mL,较优化前提高了3.66倍,并对该重组菌进行了7L罐放大实验,结果显示在培养24小时产酶达到高峰,酶活力为1255.8 U/mL。     

嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶Ⅰ在毕赤酵母中的高效表达

嗜热毛壳菌ChaetomiumthermophilumCT2可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RT-PCR扩增cbh1成熟蛋白的编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.42mg/mL。表达蛋白分泌到培养基中,分子量约80kD;以脱脂棉为底物测得酶活为21U/mL。表达蛋白在60℃稳定,70℃保温60分钟仍保持90%的酶活力,具有较高的热稳定性。     

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602 -1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(ot-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E coli M15后,得到重组菌株E coli M15 (PQE30/cgt).在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌.酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果.通过SDSPAGE验证了上述结论.酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1％可溶淀粉24h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2％,α和β的峰面积比约为3.4:1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景.     

碱性α-淀粉酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究

将已克隆的碱性α-淀粉酶基因信号肽编码序列去除,用PCR的方法加入酶切位点,然后与表达载体pHIS1525连接转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-pHIS1525-JH,并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌YYBm1原生质体,获得基因工程菌YYBm1 -pHIS1525-JH.SDS-PAGE分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达.酶学性质研究表明,该酶的最适温度与pH值分别为60℃与pH8.5,在pH7.0 - 10.5之间具有较好的稳定性,Km值为1.94 mg/mL,酶活力可达2516.5 U.     

抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(Clenbuterol, CBL)单链抗体(scFv)表达载体, 实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E- CBL质粒为模板, 扩增CBL的scFv基因, 与pPICZaA载体重组, 然后以重组质粒pPICZaA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6 个组氨酸(6×His)片段, 再与载体pBV220连接, 转化大肠杆菌DH5a, 阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体, 并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段, 与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37 kD, 能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制, IC50值为4.55 ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达, 为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。     

外源表达γ-内酰胺酶菌株的构建及发酵条件优化

我们构建了重组γ-内酰胺菌株E. coli BL21/pCDFDuet-γ-lactam,研究了发酵产γ-内酰胺酶的条件并进行了优化。研究结果表明,将pCDFDuet-1表达载体转化到含有γ-内酰胺酶基因的感受态E. coli中,得到重组γ-内酰胺菌株E. coli BL21/pCDFDuet-γ-lactam,通过IPTG诱导表达和HPLC检测发现,重组酶可以水解(+)γ-内酰胺,其e.e.值比E. coli BL21/γ-lactam表达提高了约30%。重组菌中(+)γ-内酰胺酶蛋白表观分子量为50 kD。对重组菌株发酵条件进行了初步研究,结果进一步表明,当选择碳源葡萄糖5 g/L、温度30℃、接种量4%、装液量100 mL/500 mL,转速180 r/min条件下,(+)γ-内酰胺酶含量最高,e.e.值约98%。本研究为探索出一条适合规模化生产的酶催化反应工艺提供参考,该工艺的意义不仅可以节约经济,而且对环境友好,可以替代化学工艺。     

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,得到重组质粒pHBM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM220)、GS115(pHBM220)、SMD1168(pHBM220)分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM220)所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。     

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶异源表达研究

目的：以地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶基因（amyL）为报告基因,构建含不同启动子的枯草杆菌表达载体,转化枯草杆菌,并对重组菌的酶活进行分析,比较不同启动子对amyL基因在枯草杆菌中表达的影响。方法：以高温α-淀粉酶高产菌株B.licheniformis0204染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyL并分别与PQ启动子和P43启动子进行连接构建表达载体pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL,化学法转化枯草杆菌1A717,筛选得到重组转化子后对重组菌的表达产物进行SDS-PAGE和酶活检测。结果：重组菌摇瓶发酵105h后测定高温α-淀粉酶酶活,B.subtilis1A717（pUB-PQ-amyL）的最高酶活为280.1U/mL,B.subtilis1A717（pUB-P43-amyL）的最高酶活为190.5U/mL。结论：PQ启动子调控的高温α-淀粉酶最高表达水平是P43启动子调控的最高表达水平的1.47倍,说明PQ启动子能使amyL基因在枯草杆菌中更高效地表达。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

SHMT基因工程菌的构建及高效表达

以质粒ｐＴ７-７和ｐＢＲ３２２为载体,构建ＧｌｙＡ基因的重组质粒,继而得到１２株基因工程菌（ＣＷＳ系列）。其中,高表达菌株ＣＷＳ-７的ＳＨＭＴ酶表达量占全菌可溶蛋白的４７％,是其宿主菌的５６倍;改善培养条件后,ＣＷＳ-７中ＳＨＭＴ酶活力可达宿主菌的１０６倍     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶在大肠杆菌表达的研究

研究重组EB病毒胸苷激酶(thymidine kinase of Epstein-Barr virus,EBVTK)在大肠杆菌中的表达,将EB病毒的tk基因与原核表达载体pBV220进行重组,构成质粒pBV220/tk,并在大肠杆菌DH5α中获得表达;采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定,SDS-PAEG电泳和Western blot反应检测蛋白的表达。结果显示成功地构建了pBV220/tk质粒,并有重组蛋白的表达,该重组蛋白可与鼻咽癌病人血清发生特异性反应。结果表明该重组蛋白可作为抗原应用于鼻咽癌病人血清TKIgA抗体的检测,为重组TK的生产,临床应用提供了实验依据。     

共表达HAC1和分子伴侣基因对甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响

为了提高甘露聚糖酶ManA在毕赤酵母中分泌表达的酶活,选择毕赤酵母内质网未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)激活调控因子HAC1与5种毕赤酵母蛋白折叠相关的分子伴侣ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP,通过构建pPICZA-HAC1等6种胞内表达重组质粒,分别电转化至分泌表达ManA的毕赤酵母重组菌中胞内共表达,并分析其重组菌摇瓶发酵时ManA表达的影响。结果发现在摇瓶发酵水平,胞内共表达HAC1、ERO1、PDI的重组菌发酵上清液中的ManA酶活力分别提高了26%、15%、20%,其重组菌发酵上清液的酶活力分别达到1 014 U/mL、925 U/mL、965 U/mL。通过对各重组菌上清液酶活力、胞内滞留酶活力、上清液蛋白浓度数据进行分析,进一步选择将HAC1、ERO1、PDI进行两基因或三基因组合,并分别在分泌表达ManA的重组菌胞内共表达,但各共表达重组菌发酵上清液的酶活力都没有进一步的提升。单独共表达HAC1或者分子伴侣ERO1、PDI可以辅助ManA的正确折叠,提高其蛋白表达。     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达*

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一