人成纤维细胞生长因子受体2IIIc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

含人纤溶酶原K5基因的腺病毒载体制备和功能研究

应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA基因,与真核表达载体pcDNA3重组,形成重组质粒pcDNA3K5,与穿梭质粒pShuttle 重组得pShuttleK5,经与腺病毒DNA重组,PCR鉴定正确,即为pAdK5。脂质体法将其转染293细胞后,制备细胞裂解液;噬斑分析法测定病毒滴度为5×10⁸ pfu/mL。将病毒以不同的感染系数(MOI)感染人脐静脉内皮细胞株ECV304和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MTT法检测两者的增殖情况：ECV304细胞增殖受抑制,而MDA-MB-231细胞增殖未受明显影响。将感染病毒的ECV304细胞接种于ECMatrix^TM胶,显示内皮细胞分化和毛细血管管腔形成受抑制。表明所构建的含人纤溶酶原K5基因的重组复制缺陷型腺病毒具有抑制ECV304细胞增殖、分化和管腔形成的作用而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

miR-29b2c重组腺病毒的构建及对胃癌细胞增殖和迁移的影响

构建了miR-29b2c重组腺病毒Ad-miR-29b2c,考察了其对HGC-27、MGC-803胃癌细胞增殖及迁移的抑制作用。采用PCR从基因组扩增miR-29b2c片段,并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-29b2c,经酶切及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架载体共转化BJ5183感受态,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-29b2c,再经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行包装。重组腺病毒扩增后感染HGC-27细胞,通过MTT及细胞迁移实验观察Ad-miR-29b2c对HGC-27、MGC-803细胞增殖及迁移的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-29b2c对HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达的影响。酶切、测序及荧光定量PCR结果表明重组腺病毒构建成功,miR-29b及miR-29c在HGC-27细胞过表达。MTT实验表明Ad-miR-29b2c能显著抑制HGC-27、MGC-803细胞增殖。细胞迁移实验表明Ad-miR-29b2c能显著抑制HGC-27、MGC-803细胞迁移。此外,Ad-miR-29b2c能显著降低HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达水平。综上所述,构建了miR-29b2c的重组腺病毒,并发现其可以抑制胃癌细胞HGC-27和MGC-803的增殖及迁移,该作用可能与miR-29抑制HGC-27、MGC-803细胞δ-catenin蛋白表达有关。     

Ad-ERα-36-Fc-GFP的制备及鉴定北大核心CSCD

ERα-36是雌激素受体α新亚型,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及耐药,可作为治疗靶点,但目前仅有小分子靶向药物研发。利用重组腺病毒携带诱饵受体,可进行靶向ERα-36的基因治疗探索。首先通过基因工程技术,构建可表达由Igκ信号肽引导分泌的重组融合蛋白ERα-36-Fc的穿梭质粒pDC316-Igκ-ERα-36-Fc-GFP;利用AdMax;腺病毒包装系统进行Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的包装、鉴定及扩增;感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231并进行表达及功能验证。结果表明成功制备Ad-ERα-36-Fc-GFP重组腺病毒,可高效感染三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,表达并分泌ERα-36-Fc重组蛋白,显著抑制EGFR/ERK信号通路。Ad-ERα-36-Fc-GFP腺病毒的制备为进一步开展靶向ERα-36的肿瘤基因治疗研究奠定基础。     

FGFR2Ⅲc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

目的:构建人FGFR2Ⅲc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2Ⅲc的重组细胞株,初步研究FGFR2Ⅲc对L6细胞的作用.方法:从人胎盘组织中获得FGFR2Ⅲc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2Ⅲc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2Ⅲc.将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2～4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株.RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2Ⅲc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系.结果:构建了舍人FGFR2Ⅲc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2Ⅲc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化.结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2Ⅲc的重组L6细胞株,FGFR2Ⅲc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2Ⅲc基因与成肌分化功能相关性奠定基础.     

BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响

旨在研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)基因表达后对人乳腺癌细胞MDA-MB-231BO生物学特性的影响。应用pSilencer5.1-U6Retro构建针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293细胞制备病毒悬液感染MDA-MB-231BO细胞,利用嘌呤霉素筛选抑制BSP表达的乳腺癌细胞。Western blotting检测细胞内BSP蛋白表达,采用MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示,成功构建BSP基因RNAi稳定转染的231BO-BSP27细胞。231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为69.3%,与对照组细胞相比,231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率明显降低;S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞增多。由此证实,逆转录病毒介导的RNAi能实现BSP基因稳定沉默,从而抑制MDA-MB-231BO细胞的生长和增殖。     

重组p16腺病毒的构建及其对人白血病细胞的抑制作用

为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及野生型 p1 6基因的抗肿瘤特性 ,构建了复制缺陷型重组 p1 6腺病毒 .首先将 p1 6全长 c DNA插入穿梭质粒 p Ad CMV产生重组质粒 p Ad-CMV- p1 6,然后通过脂质体介导与 p JM1 7共转染 2 93细胞 ,经同源重组产生 E1区缺失的重组腺病毒空斑 .用纯化后的腺病毒感染人白血病细胞株 HL- 60后 ,PCR及 Western blot分析显示在感染细胞中有外源性 p1 6 c DNA存在和 p1 6蛋白表达 ;被感染的 HL- 60细胞的生长受到明显抑制 ,而未感染细胞及对照腺病毒感染的细胞没有受到抑制 .结果表明 ,腺病毒作为一种新型基因转移载体 ,可有效地介导肿瘤抑制基因 p1 6的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景 .     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

构建MicroRNA-29a和microRNA-29c腺病毒并探讨其对膀胱癌细胞增殖能力的影响

构建miRNA-29a/c的重组腺病毒并观察其对膀胱癌T24细胞增殖能力的调控。以人全基因组DNA为模板,PCR扩增miR-29a、miR-29c,克隆至腺病毒穿梭载体pAdtrace-TO4-CMV。重组穿梭载体经pme I线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy-1-miR-29a、pAdEasy-1-miR-29c,pac I线性化后转染HEK-293细胞,进行包装和扩增。实时荧光定量PCR检测感染腺病毒的膀胱癌T24细胞中miR-29a、miR-29c的表达水平,并利用CCK-8实验检测细胞增殖能力。经DNA测序和限制性内切酶分析显示,重组腺病毒质粒pAdEasy-1-miR-29a、pAdEasy-1-miR-29c构建成功;感染腺病毒Ad-miR-29a和Ad-miR-29c后,经实时荧光定量PCR检测,膀胱癌细胞中miR-29a、miR-29c表达显著增高(P0.01);过表达miR-29a/c后的CCK-8实验显示,细胞增殖能力明显低于对照组(P0.05)。以上说明已成功构建miR-29a、miR-29c腺病毒,过表达miR-29a/c可抑制膀胱癌细胞的增殖。     

Akt3稳定表达细胞株的建立及其对MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的 构建人蛋白激酶Bγ（Akt3）基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对MDA-MB-231细胞增殖的影响.方法 从流产胎儿脑组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增Akt3 cDNA的全长序列后克隆入pEGFP-N2质粒中,构建成Akt3基因真核表达载体,然后转染入MDA-MB-231细胞中,新霉素筛选稳定转染细胞克隆,通过MTT实验,研究转染Akt3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误.Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在MDA-MB-231细胞中表达良好,而转染空载体及未转染细胞对照中未见有此融合蛋白质条带;MTT结果显示AKT3表达上调的稳定克隆组,其增殖活性显著高于空载体稳定转染细胞组及未转染亲代细胞组,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 Akt3过表达可增强MDA-MB-231细胞的增殖.     

腺病毒介导犬干扰素-γ基因的表达及其体外抗犬细小病毒的作用

[目的]构建含犬干扰素-γ(c IFN-γ)基因的重组腺病毒,并在培养的犬肾细胞MDCK中分析其抗犬细小病毒的活性.[方法]首先将cIFN-γcNDA基因克隆到腺病毒穿梭质粒中,构建成含cIFN-γ基因的腺病毒穿梭质粒pShuttle3-cIFN-γ.利用特异的酶切位点,通过直接连接法将cIFN-γ表达盒插入到腺病毒基因组质粒pAdeno-X中,构建成含cIFN-γ基因的腺病毒基因组质粒pAd-cIFN-γ.pAd-cIFN-γ质粒经酶切线性化后转染人胚胎肾细胞HEK293T,在细胞中拯救出含有cIFN-γ基因的复制缺陷型重组腺病毒.然后用该重组腺病毒处理(感染)培养的犬肾细胞MDCK,再用犬细小病毒感染重组腺病毒处理的细胞,分析重组腺病毒在体外抗犬细小病毒的活性.[结果]通过连接法构建了含cIFN-γ基因的重组腺病毒,构建的重组腺病毒能够介导cIFN-γ在MDCK细胞中进行分泌表达.用含cIFN-γ基因的重组腺病毒处理MDCK细胞,可明显地抑制犬细小病毒在细胞中的增殖,表明构建的重组腺病毒具有明显的抗犬细小病毒的活性.[结论]构建了含cIFN-γ基因的重组腺病毒,并证明该重组病毒在体外具有明显的抗犬细小病毒的活性.     

构建MicroRNA．29a和microRNA-29c腺病毒并探讨其对膀胱癌细胞增殖能力的影响

构建miRNA．29a／c的重组腺病毒并观察其对膀胱癌T24细胞增殖能力的调控。以人全基因组DNA为模板,PcR扩增miR-29a、miR-29c,克隆至腺病毒穿梭载体pAdtrace．TO4-CMV。重组穿梭载体经pmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy—1—miR-29a、pAdEasy—1．miR-29c,pacI线性化后转染HEK-293细胞,进行包装和扩增。实时荧光定量PcR检测感染腺病毒的膀胱癌T24细胞miR-29a、miR．29c的表达水平,并利用CCK．8实验检测细胞增殖能力。经DNA测序和限制性内切酶分析显示,重组腺病毒质粒pAdEasy—1—miR．29a、pAdEasy．1-miR-29c构建成功：感染腺病毒Ad—miR-29a和Ad—miR．29c后,经实时荧光定量PCR检测,膀胱癌细胞中miR．29a、miR．29c表达显著增高（P〈0．01）;过表达miR．29a／c后的CCK．8实验显示,细胞增殖能力明显低于对照组伊〈0．05）。以上说明已成功构建miR．29a、miR．29c腺病毒,过表达miR．29a／c可抑制膀胱癌细胞的增殖。     

抑癌基因Fhit重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

目的：构建携带抑癌基因Fhit的重组腺病毒并通过其研究Fhit蛋白对结直肠癌细胞增殖能力的影响。方法：利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段,Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后,将基因片段导入ptrack-CMV穿梭质粒中,构建重组穿梭载体ptrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ 单酶切线性化的ptrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌,使ptrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit,将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞,采用蛋白印迹法检测外源Fhit蛋白的表达,并进一步观察其对细胞增殖能力的影响。结果：我们成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒,且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中,Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。结论：在结肠癌细胞中,Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色,而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。     

BMP9对人乳腺癌细胞MDA-MB-231骨转移的影响及可能机制

探讨BMP9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞骨转移能力的影响及其可能的机制。扩增高滴度的BMP9表达腺病毒,感染MDA-MB-231细胞,制备表达BMP9的重组MDA-MB-231/ BMP9细胞,以此作为实验组;同时以含GFP的空载腺病毒感染该细胞为MDA-MB-231/GFP,联合MDA-MB-231共同作为对照组;RT-PCR及Western blot检测重组MDA-MB-231/ BMP9细胞中BMP9以及磷酸化Smad1(PSmad1)的表达;定量PCR及Western blot检测三组细胞中CTGFmRNA和蛋白水平的表达情况,最后结合X片运用免疫组织化学染色的方法检测三组标本中CTGF的表达。结果发现重组MDA-MB-231/ BMP9细胞中存在BMP9的表达;与对照组细胞相比,MDA-MB-231/ BMP9细胞中存在PSmad1的活化增强及CTGF的表达下调;X片发现实验组裸鼠胫骨溶骨性缺损减少;瘤体组织免疫组化发现实验组CTGF表达下调。所以BMP9可以在体内抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的骨转移并且这种抑制作用有可能是通过下调CTGF来实现的。     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。     

SK-1基因敲除联合阿霉素抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移

目的:将乳腺癌MDA-MB-231细胞的SK-1基因敲除,结合阿霉素对细胞增殖和迁移的抑制作用,研究乳腺癌的治疗新方法.方法:将阿霉素分 别感染野生型及SK-1敲除型MDA-MB-231细胞,3H-TdR掺入法分析细胞增殖,RT-PCR检测细 胞内SK-1的mRNA表达量,Western blot 检测SK-1蛋白表达及细胞凋亡相关因子caspase 3的蛋白表达,Transwell法分析细胞迁移. 结果:阿霉素感染MDA-MB-231细胞,抑制细胞增殖和迁移,细胞存活率明 显下降;阿霉素呈浓度依赖性及时间依赖性抑制SK-1 mRNA及蛋白水平表达;将SK-1基因敲 除,细胞迁移率下降,协同阿霉素的作用,迁移率进一步下降,且将导致细胞凋亡.结论: SK-1基因敲除可增强阿霉素对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用.     

MiR-22重组腺病毒的构建及对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响

文中构建了miR-22重组腺病毒Ad-miR-22,分析了其对HepG2细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。通过PCR方法,扩增了miR-22的前体及侧翼序列,酶切后克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-22,经PCR及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,直接转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞BJ5183,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-22,最后经PacⅠ线性化后转染包装细胞系293A。重组腺病毒经过3轮扩增后感染HepG2细胞,通过荧光定量PCR检测miR-22表达水平。通过葡萄糖摄取实验观察Ad-miR-22对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-22对HepG2细胞SIRT1在蛋白质水平的表达及GSK-3β磷酸化水平的影响。采用荧光定量PCR检测miR-22对PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表达的影响。结果表明,重组腺病毒Ad-miR-22感染显著增加HepG2细胞miR-22表达水平。此外,Ad-miR-22显著抑制胰岛素诱导的HepG2葡萄糖摄取,并通过下调GSK-3β磷酸化抑制胰岛素信号通路的激活。Ad-miR-22反转胰岛素对糖异生关键酶表达的抑制作用,并下调SIRT1基因在蛋白质水平的表达。综上所述,构建了miR-22的重组腺病毒,发现其显著增加糖异生,抑制HepG2细胞葡萄糖摄取,该作用可能与miR-22调节SIRT1在蛋白质水平的表达有关。     

应用Ad Easy载体系统构建人β2-AR基因重组腺病毒

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经PmeI酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒.重组穿梭载体经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实.电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒.转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础.     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体.首先将P1-2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle-CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv-p12x3c和pAdcmv-p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中.重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变.取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24~48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT-PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达.取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在.本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.     

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将人SERCA2a基因全长c DNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMV SERCA2a重组质粒,经Pme I酶切线性化,采用电击法转入到已含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性.结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径.