用痘苗病毒天坛疫苗株做载体表达乙型肝炎病毒Adw亚型表面抗原

近几年,美国Moss和Paoletti等的实验室,成功地用痘苗病毒做载体,表达乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、流感病毒血凝素、单纯疱疹等基因。並且观察到,用含有HBsAg基因的重组痘苗病毒免疫的猩猩,对乙型肝炎病毒的攻击,有明显的保护作用。 我们用从美国Joklik实验室引进的、含痘苗病毒WR株Hind Ⅲ F片段的质粒p169,     

重组痘苗病毒在基因工程中的应用及展望

1982年以来,美国Moss及Panletti实验室相继报道了以痘苗病毒为载体,把单纯疱疹病毒TK基因、乙肝病毒表面抗原基因,流感病毒血凝素基因等重组至痘苗病毒基因组的特定部位,获得能表达外源基因的重组痘苗病毒。由于重组痘苗病毒具有一些特殊的特点和优点。     

痘苗病毒作为真核载体的研究现状及展望

1982年以来,美国Moss及Paoletti实验室相继报导了采用痘苗病毒作为载体,把单纯疱疹病毒TK基因、乙肝病毒表面抗原基因、流感病毒血凝素基因等重组至痘苗病毒基因组的特定位置上,得到能表达外源基因的重组痘苗病毒株。由于重组痘苗病毒具有一些特殊的特点,有希望发展成为一种新型的经济而有效的单价或多价疫苗,因而颇受学者们的重视。     

痘苗病毒天坛株4b启动子的转录效率

痘苗病毒天坛株４ｂ启动子的转录效率崔虹容敏清王芝山侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室,北京１０００５２）关键词痘苗病毒,４ｂ启动子痘苗病毒载体在多价基因工程疫苗的研制中十分重要,外源基因在重组痘苗中的高效表达主要依靠启...     

辛德毕斯病毒载体的研究进展

辛德毕斯病毒（Sindbis virus,SIN）属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）,全世界各大洲均有分布,是由吸血的蚊虫等传播的虫媒病毒,可引起“辛德毕斯综合热”,表现为发热、倦怠、头痛、关节痛和皮疹等,可自愈。无论从病毒形态、结构、病毒复制和翻译等功能辛德毕斯病毒均集中体现了动物病毒的特征,使其成为研究动物病毒基本规律的模型病毒,因此对该病毒的研究成为热点。 　　自1983年Brenard Moss首次将痘苗病毒改造为痘苗病毒载体以来［1］,病毒载体的研究一直是病毒学中一个十分活跃的领域。早期的人们主要把精力集中在DNA病毒载体上,如痘苗病毒、腺病毒、疱疹病毒等［1］。     

利用大肠杆菌质粒检测与分离痘苗病毒的启动子

本文发现,痘苗病毒DNA一些巳知的启动子序列和一些功能尚不清楚的DNA片段,可以在大肠杆菌中起始氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol Acetyltrsnsferase,简称CAT)基因的转录和表达,使转化细菌呈现氯霉素抗性表型,这一结果证明,痘苗病毒的启动子可以被大肠杆菌的RNA多聚酶所识别并有效工作。同时发现不同启动子具有不同的强度,利用大肠杆菌质粒分离和检测痘苗病毒的启动子序列,不仅可以研究痘苗病毒基因组的表达调节特点,而且也为组建痘苗病毒表达载体提供了一个快速、简便可靠的方法。     

痘苗病毒不同启动子对乙型肝炎病毒表面抗原表达的影响

利用DNA重组和细胞体内同源重组技术,分别获得了P7.5启动子和P11启动子单独带动的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组痘苗病毒和同一个重组痘苗病毒中含有P7.5和P11启动子分别带动一个HBsAg基因(正反两个插入方向)的四种重组痘苗病毒,比较了它们对HBsAg表达的影响。含P7.5启动子的比含P11启动子的重组痘苗病毒表达的HBsAg水平更高些;在同一个重组痘苗病毒中P7.5和P11两个启动子分别带动HBsAg基因时,两个启动子同向转录表达的HBsAg水平较低,而两个启动子又向转录时表达的HBsAg水平较高,但均没有单一P7.5启动子带动的HBsAg基因的表达水平高。     

密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率影响的研究

为了研究密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率的影响,分别采用痘苗病毒及其宿主细胞的优势密码子对绿色荧光蛋白基因进行改造,利用荧光、Western blot和FCM等方法分析其在痘苗病毒载体系统的表达水平。结果显示,全部采用痘苗病毒优势密码子(富含A T)和全部采用宿主细胞优势密码子(富含G C),以及部分使用宿主细胞优势密码子的三种绿色荧光蛋白基因都能够有效表达,表达水平相近,表明痘苗病毒载体对目的基因密码子的使用具有很好宽容性。为了探讨这种宽容性的机理,分别利用在胞核内和在胞浆内转录的质粒载体对不同密码子偏性的绿色荧光蛋白基因进行表达分析。结果显示,胞核内转录目的基因的pcDNA3质粒载体能有效表达富含G C的绿色荧光蛋白基因,不能有效表达富含A T的绿色荧光蛋白基因,而胞浆内转录目的基因的pSCA质粒载体能同样有效表达上述不同密码子偏性的目的基因。这些结果表明,位于胞浆内的富含A U的转录产物能够有效表达,细胞核内生成的富含A U的转录产物可能受核膜屏障或其它核内因素影响而不能有效表达。因此,胞浆内繁殖的特性是痘苗病毒载体具有密码子宽容性的主要原因。此研究为痘苗病毒载体和常用真核表达载体的选择使用提供了重要实验依据。     

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法,对HPV581L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰,并保留氨基酸不变.选用非复制型重组痘苗病毒为载体,将修饰的L1基因1.5kb和L2基因1.4kb分别插入痘苗病毒表达载体pJSD的7.5k和H6早期启动子之后,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组.经单斑筛选纯化,获得共表达HPV58L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株.该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交分析,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV581L1及L2蛋白.此结果为HPV58型非复制型重组痘苗病毒疫苗人用株的研究打下了基础.     

非复制型痘苗病毒的生物学性状研究进展

痘病毒被广泛用于针对多种感染性疾病和癌症的疫苗研究,而非复制型痘苗病毒的发展又进一步提高了其安全性。来源于中国天花疫苗株的复制缺陷型痘苗病毒天坛株(NTV)正是一株非复制型痘苗病毒。为了促进未来NTV作为疫苗候选株在临床中的应用,我们对NTV与另外2株非复制型痘苗病毒,即改良痘苗病毒安卡拉株(MVA)和NYVAC的生物学性状做简要综述,主要讨论了它们的基因组结构、体外生长特性、病毒复制和形态发生、组织中的病毒分布和病毒-宿主细胞间的相互作用。     

世界卫生组织讨论重组痘苗病毒用作活疫苗的结论和建议

1984年11月中旬世界卫生组织(WHO)召开了一个非正式会议,讨论了有关基因重组痘苗病毒作为人和兽用活疫苗的问题。会议着重研究了这种疫苗的设计、优缺点、进一步研究的必要性及WHO在协调和赞助活动方面应起的作用,与会者认为,下述几个方面应继续进行研究: 一、对疫苗效果要做进一步的分子水平的研究。重组痘苗病毒作为疫苗的效果,将取决于其诱导保护     

高效重组痘苗病毒天坛株载体系统的建立

以痘苗病毒为载体的溶瘤病毒作为癌症治疗的新方向效果显著。同时,痘苗病毒还可以作为疫苗载体抵抗HIV、H5N1等病毒感染。因技术限制,重组痘苗病毒主要通过同源重组的方法获得,但此方法获得重组病毒的效率较低。随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9技术成功应用于多种动物、组织和细胞的基因编辑中,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术建立高效重组痘苗载体系统。本研究首先构建了三个靶向痘苗病毒天坛株TK区的gRNA-Cas9的质粒以及重组质粒pJ2R-EGFP,通过瞬时转染gRNA-Cas9或建立gRNA-Cas9稳定细胞系后,导入重组质粒pJ2R-EGFP并感染VTT,获得表达EGFP的重组病毒。此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率比传统的同源重组方法大大提高。因此,本研究建立的高效痘苗病毒载体重组系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值。     

表达甲型肝炎病毒抗原的重组痘苗病毒(VMS11 HAV25)的免疫原性

甲型肝炎(甲肝)病毒基因全部开放读码框架cDNA重组于痘苗病毒天坛株DNA的HindⅢM片段,获得了重组痘苗病毒VMS11HAV25。用10~7PFU或10~8PFU病毒量皮内免疫家兔,能诱生甲肝病毒抗体,其滴度与免疫剂量、免疫次数及间隔有关。组织培养中和试验表明,该抗体具有中和甲肝病毒的能力。VMS11HAV25的免疫效果似优于本实验室已报道的另一株甲肝病毒基因重组于TK区的重组痘苗病毒Re41。     

复制缺陷型痘苗病毒天坛株的细胞生物学特性及复制缺陷机制探究

痘苗病毒减毒株作为基因表达载体,广泛应用于多种疾病的预防和治疗。复制缺陷型痘苗病毒天坛株(Non-replicating Tiantan vaccinia virus,NTV)作为一株高度减毒的痘苗病毒株,其生物学特性和复制缺陷机制还有待研究。探究NTV细胞生物学特性和复制缺陷机制。在不同种属和组织来源的细胞中测定NTV复制能力、细胞嗜性和毒力;Western Blot检测HeLa细胞中的NTV的A17/A27蛋白表达水平,Real-time PCR检测晚期蛋白A17/A27转录水平。NTV在BHK-21、CEF细胞中可有效复制和扩散,而在Vero细胞及人源细胞HeLa、2BS、Hep-2和143TK-中均不能有效复制;在HeLa细胞中,晚期蛋白A17和A27蛋白表达受阻,而转录水平基本不变。NTV是一株复制缺陷型痘苗病毒,在多种细胞中复制和扩散受限;NTV晚期蛋白A17和A27的表达受阻且与蛋白表达转录水平无关,初步判定蛋白表达受阻发生在蛋白翻译阶段。     

含H5N1多个结构抗原的DNA疫苗与重组痘苗病毒疫苗联合免疫小鼠可明显增强免疫原性

本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案。利用本实验室前期构建的含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗及重组痘苗病毒(天坛株)疫苗,采用不同方案(单独或联合)免疫BALB/c小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体及M1与M2特异性抗体)和细胞免疫应答(IFN-γELIS-pot)的特点。结果表明:DNA疫苗与重组痘苗病毒(天坛株)疫苗联合免疫可以激发较强的多个抗原特异的免疫应答,尤其是体液免疫应答,明显优于DNA疫苗或重组痘苗病毒(天坛株)疫苗单独免疫;联合免疫方案中DNA疫苗初免所激发的HA与NA特异的体液免疫应答强于重组痘苗病毒(天坛株)疫苗初免,然而M1与M2特异的体液免疫应答则反之。本研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础。     

痘苗病毒通用表达载体pGJP-5的组建

我们从弱毒的痘苗病毒广-9株出发,构建了一个通用的痘苗病毒表达载体pGJP-5。广-9株的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因既作为表达载体与痘苗病毒基因组体内重组的同源顺序,又作为重组病毒的筛选标记。在TK结构基因中插入了编码痘苗病毒7.5K蛋白基因的启动基因(P_(7.5)),它可以有效地启动外源基因在痘苗病毒中表达。同时启动基因P_(7.5)的3′末端有BamHⅠ、SmaⅠ、SacⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点可供外源基因插入。     

痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析

通过我国痘苗病毒天坛株(疫苗株)全基因组核苷酸序列的测定,对痘苗病毒基因组的一级结构进行了详细的分析,发现天坛株全基因组由189274个碱基对和碱基组成,与其它痘苗病毒株相比,在病毒基因组旁侧区限制性内切酶Hind Ⅲ-C,B及中央区Hind Ⅲ-A片段出现多个DNA片段的缺失和新的DNA片段的插入,这些片段中编码的某些多肽目前已知与病毒的生物学性状有关,对阐明痘苗病毒疫苗株与非疫苗株毒力上的差别及正痘病毒属成员的致病机理等方面的研究提供了线索.除此之外,有关病毒启动子、开放读码框架的分布特点、G+C含量及密码子使用频率等基因组结构特点的分析,也为研究基因表达的调控机制和利用该病毒作为载体进行基因工程重组疫苗的开发奠定了基础.     

应用痘苗病毒为载体表达人白细胞介素4的研究

在真核细胞中表达近似于人类天然糖基化的白细胞介素４（ｈＩＬ－４）,为重要的研究课题,利用基因工程技术,以痘苗病毒作为载体,使之在真核细胞中表达ｈＩＬ－４,为生产糖基化的ｈＩＬ－４开辟新的可能途径,在痘苗病毒表达载体ｐＪ１２０质粒的基础上,组建了含有ｈＩＬ－４基因的ｐＪ１２０／ｈＩＬ－４重组质粒,该质粒以痘苗病毒的胸腺嘧啶核苷激酶（ＴＫ）基因为侧翼序列,中间插入痘苗病毒的Ｐ１１和Ｐ２５两个转录方向相     

美国微生物学会会讯

根据Moss等在Proc Natl Acad Sci USA(2004;17：6641～6646)上报道用痘苗(Ankara)表达严重急性呼吸道综合征．冠状病毒(SARS-CoV)的S蛋白免疫小鼠,可获得中和抗体,并可对呼吸道吸人或注射的SAILS病毒感染有保护作用。     

痘苗病毒载体在病毒疫苗研制上的应用

痘苗病毒作为真核表达载体已广泛应用于外源基因的表达,并日益受到重视,本文就痘苗病毒的生物学特性,重组痘苗病毒的构建原则,外源基因在重组痘苗病毒中的表达情况及重组痘苗病毒作为活疫苗的优缺点等方面作一概括性综述。