分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

用限制性内切酶HaeⅢ进行绦虫染色体G分带的研究

限制性内切酶(简称限制酶)是一类能识别并切开特定DNA序列的核酸内切酶。近几年来,一些作者用限制酶处理人和小鼠的中期染色体,观察到特征性的带纹,并且认为限制酶的显带作用与染色体上DNA片段的选择性抽提有关。这一新技术的应用,不     

识别序列为非回纹对称结构限制核酸酶的正确切割位点

限制性内切核酸酶的切割识别序列分为回纹对称和非回纹对称结构两类,由于DNA是互补双链,所以对于识别序列为回纹对称结构的限制酶,其识别序列在DNA的两条链上是一致的,可以写为一个,但对于识别序列为非回纹对称结构的限制酶来说,其识别序列应为两个,而一些工具书、参考书中仅写为一个。本通过一个酶切实验证明其识别序列为两个。同时希望通过本,敦促一些工具书、参考书更正其错误。     

限制性内切酶诱发的姊妹染色单体互换

用限制性内切酶PstⅠ,SalⅠ,PvuⅡ和BamHⅠ处理CHO细胞后,发现其SCE率升高,与对照相比,前三种酶具有显著性差异。但这些酶诱导SCE的效应与其致染色体畸变效应相比则较弱,提示引起DNA双链断裂的限制性内切酶不是SCE的强刺激物。实验结果表明,BrdU取代胸苷不能消除限制酶对底物DNA的识别及裂解。     

DNA-蛋白质相互作用的研究——EcoRI内切酶切割P_2-DNA

限制性核酸内切酶不仅是分析和操纵DNA序列的工具,而且也为研究DNA-蛋白质之间相互作用提供了一条可行的途径。核酸内切酶如何识别、结合、切割DNA,不少文章已有报道。至今没有解决的一个问题是:同一DNA分子上具有相同核苷酸顺序的不同限制位,为什么能以不同的速度为同一种内切酶切割。为了研究这个问题,我们选择P_2噬菌体DNA和EcoRI内切酶作为试验系统,用酶促反应的动力学和热力学方法研究其切割机制,所得资料表明,不同限制位点的切割速度     

限制性酶

核酸限制性内切酶是识别双链DNA中专一序列的酶,主要从原核生物中提取。限制性内切酶可分为三类:第Ⅰ和第Ⅲ类酶在同一旦白中具有修饰作用(甲基化作用)和需要ATP的限制性裂解的活性。这两种酶都识别底物DNA中非甲基化的序列,不过第Ⅰ类酶的作用是随机的,第Ⅲ类酶则切DNA的专一位点。     

II型限制性核酸内切酶在真核生物染色体显带中的应用

限制性核酸内切酶（简称限制酶)能切割DNA双链。已知的限制酶有I, II和III型三类。II型限制酶能识别专一核普酸序列,并在识别序列内有固定切割点,是分子生物学研究和基因工程重要工具酶。1980年,以II型限制酶处理印度鹿染色体,沿染色体纵轴得到选择消化结果^[16]。目前,限制酶这一应用研究发展成称为限制性核酸内切酶显带（Restriction endonuclease banding）的最新显带技术,已应用于哺乳类、鸟类、两栖类、鱼类和昆虫等真核生物。限制酶显带与其他显带法相比有其特点,特别在揭示异染色质的异质性方面有其独到之处。本文介绍此项技术的发展与现状,并指出需要进一步探索的几个主要方面。     

用限制酶显带和CMA_3/DA/DAPI荧光染色研究中国小型白兔染色体结构异染色质

限制性内切酶(restriction endonuclease)是一类能识别并切开特定DNA序列的核酸内切酶,利用限制酶处理甲醇、冰醋酸固定后的哺乳动物中期染色体标本,再经Giemsa染色,能产生不同的特征性带纹,这是近几年发展的一种新的显带技术。目前,除用于人的中期染色体研究外,     

鳞翅目基因组IIB型内切酶位点的统计分析

IIB型限制内切酶能够识别并切割特异酶切位点两端特定距离的DNA,形成粘性末端的30 bp左右的等长DNA片段。利用其特性与限制性酶切位点关联测序技术(RAD)相结合发展出2b-RAD简化基因组测序技术,应用于遗传图谱构建、种群遗传结构分析、性状定位以及细菌分型等多种研究领域。构建2b-RAD测序文库之前,需要对基因组中的IIB型限制内切酶位点进行预测与统计分析,制定有效的测序文库构建方案。本文利用Python语言构建分析基因组中IIB型限制内切酶位点的流程,预测并统计6个鳞翅目代表物种基因组含有的8个商业化IIB型限制内切酶的酶切位点,比较了各个基因组与IIB型限制内切酶之间含有的酶切位点总量、重复序列数量以及酶切间隔长度的关系,为在昆虫基因组中进一步试行2b-RAD研究提供了参考。     

pBR322DNA与8-甲氧补骨脂素光化学反应部位的碱基顺序特异性

用限制性核酸内切酶酶切试验研究了质粒pBR322 DNA经8-MOP及近紫外线作用后损伤部位的碱基顺序特异性。实验研究发现PUVA损伤的DNA在HindⅢ及RsaⅠ识别位置上酶切反应受到严重抑制,而在SphⅠ,EcoRⅠ,PvuⅡ,BamHI,PstⅠ识到位置上抑制轻微。通过对不同识别位置上碱基顺序及其光化学反应敏感性的分析,推断出DNA的TpA顺序可能是最易接受8-MOP光化学反应的部位。     

动物细胞特定基因的分离和鉴定

哺乳动物的基因组是非常复杂的,人的DNA含有大约10~7个珠蛋白基因大小的DNA顺序。其中大约60％是单拷贝基因。用物理方法还不可能提纯到1000倍以上。但是,用含有cDNA的重组质粒作为亲和介质的新的层析技术和反相层析可以充分纯化以至可以克隆带有邻近顺序的单个哺乳动物基因。 含有从基因组分离的哺乳动物珠蛋白基因顺序的重组质粒的制备,为直接分析特定DNA顺序的转录控制提供了机会。 然而,即使没有这种质粒,从含有特定珠蛋白基因和其他基因的限制酶解DNA片段中识别基因组DNA片段也是可能的。结合使用几种限制酶,并将吸附在滤膜上的DNA片段与从珠蛋白重组质粒的cDNA制备的DNA探针杂交,可以制出几种哺乳动物珠蛋白基因的限制谱。应用这项技术,插入在结构基因中的非编码顺序也已被识别和研究。     

动物细胞特定基因的分离和鉴定

哺乳动物的基因组是非常复杂的,人的DNA含有大约10~7个珠蛋白基因大小的DNA顺序。其中大约60％是单拷贝基因。用物理方法还不可能提纯到1000倍以上。但是,用含有cDNA的重组质粒作为亲和介质的新的层析技术和反相层析可以充分纯化以至可以克隆带有邻近顺序的单个哺乳动物基因。 含有从基因组分离的哺乳动物珠蛋白基因顺序的重组质粒的制备,为直接分析特定DNA顺序的转录控制提供了机会。 然而,即使没有这种质粒,从含有特定珠蛋白基因和其他基因的限制酶解DNA片段中识别基因组DNA片段也是可能的。结合使用几种限制酶,并将吸附在滤膜上的DNA片段与从珠蛋白重组质粒的cDNA制备的DNA探针杂交,可以制出几种哺乳动物珠蛋白基因的限制谱。应用这项技术,插入在结构基因中的非编码顺序也已被识别和研究。     

食用真菌线粒体DNA的直接分析

该文报道了以限制酶HaeIII酶切13个食用菌栽培品种的总DNA,在琼脂糖凝胶上直接显现线粒体DNA带的结果。结合另外两种限制酶CfoI和MSpI的酶切结果和HaeIII在其它真菌中的研究报道,提出了利用识别四个GC对的限制酶酶切真菌总DNA,直接分析线粒体DNA的方法。     

Ⅱ型限制性核酸内切酶的性质

限制性核酸内切酶(以下简称限制酶)是一类水解DNA的磷酸二酯酶。因为它能识别特定的碱基序列并能在特异位点切割DNA,在分子生物学、遗传工程等研究中已成为一种极有用的工具酶,并为研究蛋白质与核酸的相互作用提供了一个理想的模型。限制酶是在研究噬菌体与寄主相互关系这个问题时发现的。Meselson等人在1968年从大肠杆菌K_(12)中分离到第一个限制酶。从1968年至今,已发现了近500种限制酶,具有103种不同的专一性。     

识别序列为非回纹对称结构限制核酸酶的正确切割位点

限制性内切核酸酶的切割识别序列分为回纹对称和非回纹对称结构两类,由于DNA是互补双链, 所以对于识别序列为回纹对称结构的限制酶,其识别序列在DNA的两条链上是一致的, 可以写为一个, 但对于识别序列为非回纹对称结构的限制酶来说,其识别序列应为两个,而一些工具书、参考书中仅写为一个。本文通过一个酶切实验证明其识别序列为两个。同时希望通过本文,敦促一些工具书、参考书更正其错误。 Abstract:The recognizing sequence of restriction enzyme includes palindrome and nonpalindromic,and DNA is double helix complementary strands.So the recognizing sequences of palindrome enzyme in two strands of DNA were identical,and can be considered of one sequence.But for nonpalindromic restriction enzyme,the recognizing sequences of two strands of DNA were not identical.Therefore the true recognizing sequences are not only one.In this experiment,an enzyme cleavage reaction was carried out which confirmed that the true recognizing sites/sequences of nonpalindromic enzyme are two instead of one.     

人前胰岛素原双链cDNA克隆的分离和鉴定

我们从人胰岛肿瘤组织eDNA基因库中分离到一个编码人前胰岛素原的双链eDNA克隆。限制性内切酶片段分析和DNA顺序分析均证明这是一个编码人前胰岛素原的cDNA克隆。该克隆中前胰岛素原编码顺序与β－内酰胺酶基因方向相同。     

限制性片段长度多态性（RFLPS）及其原因

DNA是绝大多数生物(RNA病毒除外)携带和传递遗传信息的复杂的生物聚合体。能被限制性核酸内切酶在特定的核苷酸顺序上切割,形成各种长度的DNA片段,通过电源能将这些片段分开。 生物个体间的差异,本质上是DNA水平上的差异。这是由于进化过程中染色体DNA上核苷酸顺序发生了改变,当这种改变涉及到限制性酶切位点时,酶切后产生的DNA片段长度     

重组DNA技术在神经科学中的应用

重组DNA技术是生物工程的主要技术,它在神经科学研究中发挥着重要的作用,形成为一个新的前沿——分子遗传神经科学。重组DNA技术主要包括四方面:(1)用限制性内切酶将DNA切割成特定的片段,(2)用核酸杂交钓出特定的DNA或RNA顺序,(3)DNA克隆和扩增,(4)DNA顺序测定,再根据三联密码推断蛋白质的氨基酸排列顺序,其速度远超过经典的蛋白质化学方法。换言之,重组DNA技术可以将特定的基因从基因库中分离开来,进     

用单链和PCR相结合的方法合成绿豆胰蛋白酶抑制剂基因

本文报道用单链与PCR技术相结台的合成方法合成了胰蛋白酶抑制剂基因,包括氨基酸编码顺序、起始和终止密码子,上、下游两端的EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ限性酶识别顺序等全长共248个碱基对。合成基因的编码是参考其它植物的蛋白酶抑制剂基因的同源编码和植物基因的偏爱密码子来进行设计的。合成的基因双链经限制酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ在两端切出粘性末端后克隆到pUCl9中,克隆基因结构的正确性经过限制酶图谱和DNA序列分析得到完全的证明。     

RT-PCR法扩增的人溶菌酶cDNA的克隆及其核苷酸顺序分析

本文以人胎盘全RNA为底物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),制备出了人溶菌酶的cDNA片段。在限制性内切酶Sma Ⅰ存在的连接体系内,将此cDNA克隆入载体pUC12的Sma Ⅰ位点。用重组质粒双链DNA的末端终止法测定了其全部的核苷酸顺序,证明其全长为444bp,编码了18个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟蛋白组成的溶菌酶的前体蛋白,并证明已成功地在此cDNA的3′末端导入了两个终止密码子及一个限制性内切酶Sal Ⅰ的识别位点。由中国人溶菌酶cDNA推导出的氨基酸顺序与有关报道不同,有5个氨基酸的改变。表达蛋白的研究工作正在进行中。