东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry的表达和酶活分析

通过对东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry氨基酸序列比对分析, 发现保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代。为了探究这种突变是否会对胰蛋白酶的活性有影响, 文章构建了原核表达重组质粒pET-28a- Djtry, 转化到E.coli BL21中, 利用IPTG诱导表达, 对表达的重组蛋白进行变性、复性、纯化以及Western blotting鉴定, 获得成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品, 胰蛋白酶特异性底物BAEE, 检测Djtry酶活力与比活力。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体, 分子量约为26 kDa, Western blotting结果显示为目的蛋白, 对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现, 突变型胰蛋白酶Djtry仍然保持了胰蛋白酶催化性质, 但是催化活性相对较弱。     

东亚三角涡虫PSA蛋白的表达、鉴定及抑菌分析

PCR扩增含酶切位点的DjPsa基因(ORF),构建了DjPsa基因的原核表达载体pET-28a(+)-DjPsa,转化入Ecoli BL21(DE3)中,经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting(His-Tag抗体)分析表达蛋白,抑菌试验检测其活性.结果表明,重组质粒在E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式高效表达,其蛋白的分子大小约为25 kD;Western blotting检测说明得到的蛋白为PSA重组蛋白:抑菌试验显示复性后的PSA具有较强的抑菌作用,为进一步研究它的功能、活性提供基础.     

东亚三角涡虫cDNA文库的构建及EST初步分析

为了快速高效地分离鉴定东亚三角涡虫的发育和再生相关基因,以总RNA为模板,借助CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit和Advantage 2 PCR Kit成功构建了东亚三角涡虫的cDNA文库.经测定,cDNA文库原始库容为1.22×105个独立克隆,重组率超过98 %,插入片段平均大小为900 bp.从文库中随机挑选重组克隆测序,并在NCBI数据库中比对,结果获得208个rRNA基因,148个编码蛋白基因,78个染色体片段基因.该研究为我国涡虫发育和再生的深入研究奠定了坚实的分子基础.     

东亚三角涡虫Djtraf3基因的时空表达模式

肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)作为TRAF家族的成员之一,通过介导TLRs信号通路,参与动物的免疫反应。通过构建东亚三角涡虫Djtraf3的cDNA文库获得Djtraf3基因并分析基因结构。结果发现,该最大开放阅读框为564bp,编码的蛋白质含187个氨基酸,含有1个TRAF结构域。进化分析表明,DjTRAF3和果蝇的TRAF3聚群,位于进化树的基部;整体原位杂交结果显示,在涡虫成体及不同再生阶段,Djtraf3在整个肠部表达。这些结果为进一步探究其功能提供了依据和方向。     

东亚三角头涡虫一氧化氮合酶的组织化学定位初步研究

采用一氧化氮合酶（ＮＯＳ）组织化学定位方法研究了三角涡虫的ＮＯＳ的分布。结果表明,三角涡虫的咽部具有ＮＯＳ分布,在神经系统中未发现ＮＯＳ分布。推测咽部ＮＯＳ可能与其摄食有关。     

东亚三角涡虫RhoA基因的原核表达及组织定位

为了表达东亚三角涡虫RhoA蛋白,采用温控表达载体pBV220-IL1,构建了原核表达重组质粒pBV220-IL1-RhoA,转化到E.coli DH5α中,利用42℃热激诱导表达,并进行了分离纯化和Western杂交鉴定,利用荧光免疫组织化学技术检测了在涡虫体内的分布。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白约为18 kDa,Western杂交结果显示是目的蛋白,荧光免疫组织化学结果表明RhoA蛋白在东亚三角涡虫神经系统处表达。     

鲁中山区东亚三角头涡虫有性生殖过程研究初报

于2005年3-5月、9～11月对生活于鲁中山区的东亚三角头涡虫（Dugesia japonica）的有性生殖过程进行了研究,发现鲁中山区东亚三角头涡虫1年只有1次有性生殖过程。卵囊产出的高峰在4月,卵囊孵化与种群密度最高峰在5月,其有性生殖过程与温度、食物、虫体大小密切相关。经实验观察1个卵囊最多能孵出涡虫幼体10条,最少3条。     

珞珈山东亚三角头涡虫群体遗传多样性贫乏的RAPD证据

无脊椎动物是在生物多样性中占优势的类群,生物多样性研究还未受人们重视。遗传多样性研究是生物多样性研究的重要方面,采用RAPD技术分析了取样于武汉大学珞珈山的一个东亚三角头涡虫群体,该群体多态位点比例为11.3%,遗传相似度0.9505～1.0000,平均遗传相似度为0.9784,Shannon多样性指数为0.180,UPGMA聚类分析显示该群体分为两个大的分支,各项参数显示该群体的遗传多样性贫乏。根据RAPD分析结果,该东亚三角头涡虫群体遗传多样性贫乏与其周围生境退化有关,也可能与东亚三角头涡虫具有无性生殖和有性生殖这一独特的繁殖方式相关。     

东亚三角涡虫Rab蛋白cDNA序列的克隆与生物信息学分析

通过构建东亚三角涡虫(Dujesia japonica)cDNA文库,随机挑选重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得1个三角涡虫新基因——Rab蛋白基因(DjR),涡虫Rab蛋白cDNA全长2 141 bp,开放性阅读框(ORF)621bp,编码206个氨基酸,相对分子量为23.1 kD,等电点6.59,属亲水性蛋白,主要定位于细胞质中,在氨基酸第20和21位之间有信号肽剪切位点。有8个磷酸化位点。含有小G蛋白家族5个保守的鸟苷酸结合区域。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的其他23个物种的相似性为53%-90%,且符合种属之间的进化关系。     

东亚三角涡虫DjPLCβ4基因克隆及在胚胎发育中的组织特异性表达

磷脂酶C的β亚型(PLCβ)在突触传递和可塑性的调节中发挥着重要作用。东亚三角涡虫Dugesia japonica作为首次出现三胚层的两侧对称动物,是研究发育和进化的重要模式生物。为了研究DjPLCβ4基因在东亚三角涡虫胚胎发育不同阶段的表达,通过RT-PCR和RACE技术克隆并验证了DjPLCβ4 cDNA的功能与表达图谱。结果显示,DjPLCβ4基因全长3 245 bp,编码969个氨基酸。系统进化树显示,东亚三角涡虫与其他物种的PLCβ4亚型聚群,并位于两侧对称动物的基部,可能是PLCβ4的原始类型。通过整体原位杂交技术研究DjPLCβ4基因在胚胎中的时空表达,DjPLCβ4基因最开始表达于胚胎发育的第3阶段,阳性信号主要位于胚胎咽及胚带;随着发育,胚胎孵化出幼虫,DjPLCβ4基因主要表达于神经原基和中枢神经系统。综上所述,东亚三角涡虫DjPLCβ4基因参与胚胎神经原基的形成和分化。     

A small scale expression screen identifies tissue specific markers in the Dugesia japonica strain Pek-1

Freshwater planaria has tremendous capacity to reform the missing part of the body and therefore is considered as one of the most important model organism for regeneration study.At present,Schmidtea mediterranea and Dugesia japonica are the two major species utilized for laboratory manipulations.Dugesia japonica flatworms are widely distributed in the Far East including Cherry Valley region in the north-west area of Beijing,China.We reported here the establishment of an asexual Dugesia japonica strain Pek-1,as a suitable system for regeneration study.Using morphological,karyotypical as well as phyiogenetic analyses,we confirmed that these flatworms indeed belonged to Dugesia japonica.We went on to show that the commonly used in situ probes and immunohistochemistry reagents and protocols were applicable to the Pek-1 strain.Using this strain,we carried out small scale analysis on EST,RNAi and gene expression.We identified 193 unique EST sequences and 65 of them had not been reported in planarian.By RNAi analysis,we showed that 48 genes,when down-regulated individually,had no effect on regeneration.Furthermore,we identified 3 groups of tissue specific expressing genes that were useful for cell lineage analysis.We concluded that the Dugesia japonica Pek-1 swain could be another suitable animal model to regeneration research.     

A resource of single-cell gene expression profiles in a planarian Dugesia japonica

The freshwater planarian Dugesia japonica maintains an abundant heterogeneous cell population called neoblasts, which include adult pluripotent stem cells. Thus, it is an excellent model organism for stem cell and regeneration research. Recently, many single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) databases of several model organisms, including other planarian species, have become publicly available; these are powerful and useful resources to search for gene expression in various tissues and cells. However, the only scRNA-seq dataset for D. japonica has been limited by the number of genes detected. Herein, we collected D. japonica cells, and conducted an scRNA-seq analysis. A novel, automatic, iterative cell clustering strategy produced a dataset of 3,404 cells, which could be classified into 63 cell types based on gene expression profiles. We introduced two examples for utilizing the scRNA-seq dataset in this study using D. japonica. First, the dataset provided results consistent with previous studies as well as novel functionally relevant insights, that is, the expression of DjMTA and DjP2X-A genes in neoblasts that give rise to differentiated cells. Second, we conducted an integrative analysis of the scRNA-seq dataset and time-course bulk RNA-seq of irradiated animals, demonstrating that the dataset can help interpret differentially expressed genes captured via bulk RNA-seq. Using the R package “Seurat” and GSE223927, researchers can easily access and utilize this dataset.     

日本三角涡虫摄食行为的影响因素

研究了光强度、温度变化、食物种类、饥饿程度以及破坏耳突对日本三角涡虫(Dugesia japonica)涡虫摄食行为的影响。弱光和低温最利于涡虫摄食;4种人工饲料中,涡虫偏爱食熟的鸡蛋蛋黄;在一定范围内,饥饿时间长短与摄食强度呈正相关;破坏耳突后涡虫的摄食能力基本消失,“脑”对涡虫摄食是否有作用尚待进一步研究。     

15种直饮水对涡虫再生的影响

通过切割57条日本三角涡虫(Dugesia japonica),每条切割为四段,观察和比较了228个涡虫体段眼、头、尾和咽在15种市售直饮水中的再生过程。结果显示:(1)切割后的涡虫体段在矿泉水中,无解体现象的比例为66.6%;而在纯净水中为12.5%。(2)解体体段占涡虫体段总数的19.74%。(3)头部解体占解体总数的55.55%。头部解体大于50%的现象分布在纯净水,其中3种纯净水中的头段全部解体。本实验结果提示,长期饮用能使涡虫正常再生的市售矿泉水比较适宜。     

p53同系物Djp53在涡虫胚基早期发育阶段的组织特异性表达及其在再生中的作用

为了探索东亚三角涡虫Djp53基因在涡虫组织中的表达和功能,利用整体原位杂交、RT-PCR技术,检测了涡虫Djp53基因在组织中的表达分布特点,结果表明,Djp53基因在再生1、3、5天的胚基中具有较强的阳性信号,且3天的表达量最高;而在再生7、10天和成虫的实质组织中表达较弱．RNA干扰后的RT-PCR检测显示,Djp53表达量显著下降,涡虫不能正常再生或出现眼点缺陷．由此推断,东亚三角涡虫Djp53基因在早期胚基发育阶段,通过调节多功能干细胞的迁移和增殖分化影响早期胚基的形成,是涡虫早期胚基发育必不可少的一个基因,并且在涡虫成体和再生后期对多功能干细胞的维持具有重要的作用.     

日本三角涡虫神经系统的组织学观察

为了给涡虫神经生物学的比较研究提供基础资料和通过RNAi技术为研究与脑部再生有关基因的功能奠定基础,本研究使用石蜡连续切片技术,经HE和Masson染色后,对日本三角涡虫Dugesia japonica的神经系统进行观察.日本三角涡虫的中枢神经系统由脑和2条纵神经索组成,脑呈马蹄形;纵神经索从头部到尾部逐渐变细;脑部神经细胞突起连接成网状,纵神经索内神经细胞突起呈纵向排列;咽壁神经组织排列成内外2个圆筒状.这些结构差异反映出日本三角涡虫在涡虫纲系统演化中处于较高级的地位.