米曲霉在产脱氨酶过程中的超微结构动态

腺苷酸脱氨酶(AMP deaminase,EC 3.5.4.6)催化5′一腺苷酸脱氨生成5′一肌苷酸。核酸经5′-磷酸二酯酶降解后,用AMP催化其中5′一腺苷酸使其生成5′一脱苷酸。产脱氨酶高活力米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)AS3.800,在制作麸麯过程中,当米曲霉分生孢子颜色由浅黄变为绿色时,酶活力下降。现对培养1.5、2、2.5及3天的麸麯进行了电镜观察与脱氨酶活性测定,希望能找到米曲霉菌体发育过程与产酶之间的相关性。     

腺苷酸脱氨酶在乳酸克鲁维酵母中构建表达

【目的】实现鼠灰链霉菌来源经密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799)中组成型表达。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶(AMP)基因经密码子优化后作为模板,设计特异性引物,PCR扩增AMP脱氨酶基因opt-AMPD,以p KLAC1为载体构建重组表达质粒p KLAC1-opt-AMPD,经Sac II线性化后电转化法转入K.lactis GG799,筛选得到重组菌株,测定酶活,经His TrapTM HP纯化后得到AMP脱氨酶,并优化重组菌的发酵培养基。【结果】对AMP脱氨酶基因进行了密码子优化后,构建了重组K.lactis GG799/p KLAC1-opt-AMPD,实现组成型表达,密码子优化后AMP脱氨酶酶活提高到586±50 U/m L。SDS-PAGE结果显示,纯化后的AMP脱氨酶为单一条带,蛋白大小约为60 k D。优化的发酵培养基为(g/L):葡萄糖40、蛋白胨20、酵母粉15、Na Cl 8、KCl 10、Mg SO4 2,30°C、200 r/min发酵120 h,酶活达到2 100±60 U/m L。【结论】实现了密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799内的组成型表达,为实现腺苷酸脱氨酶的重组高效表达和发酵生产进行了有益探索。     

一种快速可靠的3’,5’-cAMP 磷酸二酯酶活力测定法

磷酸二酯酶(PDE; E.C.3.1.4.17.)催化cAMP分解为5′-AMP,它与质膜上催化cAMP生成的腺苷酸环化酶配合,共同控制细胞内cAMP含量.因此,观察PDE活力变化对于研究环腺苷酸在细胞代谢调控中的作用具有重要意义.PDE活力测定多采用放射性同位素标记的cAMP为底物.由于一般粗酶样品中同时存在多种5′-核苷酸酶,使5′-AMP分解而引起误差,因此常将经PDE作用后生成的5′-AMP转化为腺苷测定.基本反应如下.3′,5′-cAMP 5′-AMP 腺苷 Pi     

大白鼠腹腔巨噬细胞2''''-5''''寡腺苷酸合成酶

干扰素(IFN)或干扰素诱导剂能激活巨噬细胞,提高巨噬细胞的吞噬活力。不同来源的巨噬细胞,在体外培养条件下,用pppA2′p5′A2′p5′A(2′-5′P_3A_3)短时间刺激之后,吞噬活力也明显提高。但这两种作用之间有何关系,目前仍不清楚。因为2′-5′P_3A_3是寡腺苷酸合成酶(Esi)利用ATP合成的寡聚腺苷酸中的一种(它     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

pppA2′p5′A2′p5′A保护病毒感染细胞的普遍性

pppA2′p5′A2′p5′A(简称2′-5′P_3A_3)是干扰素作用于细胞后诱导产生的物质。干扰素的作用机理很复杂,其中之一是2′-5′寡聚腺苷酸合成酶的活力增加,此酶以ATP为底物合成2′-5′P_3A_3及其同系物2′-5′P_3An。但2′-5′P_3A_3或2′-5′P_3A_n本身是否具有抗病毒作用,干扰素的抗病毒作用是否通过2′-5′P_3A_3或2′-5′P_3A_n而进行,这是一个很     

米曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因gsdA的克隆及生物信息学分析

6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖酸,并生成NADPH,是微生物胞内磷酸戊糖途径（PPP）的关键酶。本研究以食品安全菌米曲霉CICC2012为材料,克隆获得6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(GenBank登录号：JN123468)。序列分析表明,该酶是由222个氨基酸组成的亲水性蛋白;128～134位氨基酸序列DHYLGKE为活性区域;170～176位氨基酸序列GTEGRGG可能为辅因子结合位点。进化树分析表明,米曲霉6-磷酸葡萄糖脱氢酶同其他丝状真菌及酵母的G6PDH较相似。     

产氨基酰化酶米曲霉高产菌株的选育

采用亚硝基瓜抑菌圈法对米曲霉菌株3042,AF92011,AF93018,AF93020,AF93022,AF93332进行诱变处理,从诱变菌株中筛选到几个高产氨基酰化酶菌株(3042-5,AF93020-2,AF93020-6和AF93022-5),对DL-蛋氨酸的拆分活力分别比出发菌株提高34.1%、157.6%、152.4%和145.4%,其中米曲霉菌株3042的诱变菌株3042-5最高酶活力达203.1U/ml     

固态发酵生产腺苷酸脱氨酶

对多株曲霉产腺苷酸脱氨酶的性能进行了比较,发现米曲霉3.800(Aspergillus oryzae)产酶水平较高。该菌株固态发酵产酶的适宜培养基为：以麸皮为主原料,蔗糖2％,鱼粉2％,（NH4）2SO4 0．1％,柠檬酸钠0．2％,MgSO4 0.05%,吐温－80 0．1％,含水量50％。最佳的培养条件为：250mL三角瓶装20g培养基,在28－30℃培养60h。在优化条件下,培养物酶活可达到1543．48u/g鲜曲。     

紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株

以从自然发酵黄豆酱中筛选的5株野生米曲霉为供试菌株,以这些菌株产蛋白酶(酸、中、碱)、淀粉酶(α-淀粉酶、糖化酶)活力大小为评价标准,筛选出米曲霉K61作为诱变出发菌株。采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29。将米曲霉Y29菌株应用于黄豆酱的生产中,并与目前工业生产中广泛应用的米曲霉沪酿3.042菌株进行比较。性能实验结果表明米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力明显高于米曲霉沪酿3.042菌株,但α-淀粉酶、糖化酶、生长速度和孢子数这4个指标两者的差异并不显著;制酱品质试验结果表明,米曲霉Y29菌株的酱香更浓郁一些,氨基酸态氮含量达到0.77g/100mL,高于米曲霉沪酿3.042菌株,其它指标均符合国家标准GB2718-1996。     

2′—5′寡聚腺苷酸衍生物的研究——Ⅰ.以2′-5′寡聚腺苷酸作为T_4-RNA连接酶的供体和受体合成其衍生物的方法

在干扰素的功能表达中,2′-5′寡聚腺苷酸是一类重要的媒介物。本文研究了T_4-RNA连接酶的专一性及其用于2′-5′寡聚腺苷酸衍生物合成的可能性。1980年,我们曾发现2′-5′寡聚腺苷酸可以作为RNA连接酶的受体。本文对此作了进一步的研究,证实了T_4-RNA连接酶可以将pNp(N=A,G,C,U)、pCpUpC、pCpm_2~2G等供体连到2′-5′P_3A_3受体上去,生成各种相应产物。2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸能否作为T_4-RNA连接酶的供体,有人估计不大可能。本文也证实了T_4-RNA连接酶能将供体pA~(2′)p~(5′)A连接到CpUpC、UpCpCpA、Cpm′IpψpG等受体上面去。从而说明T_4-RNA连接酶也可使用2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸作为供体。应用T_4-RNA连接酶,可以合成既含有2′-5′又含有3′-5′磷酸二酯键的寡核苷酸。本工作还证明A~(2′)p~(5′)A也可以作为T_4-多核苷酸激酶的底物。     

干扰素的功能表达机制——Ⅵ.2’-5’三腺苷酸对烟草花叶病毒增殖的抑制作用

2′-5′三腺苷酸是否能抑制植物病毒在植物组织中的繁殖,过去无人报告过。本文证实2′-5′三腺苷酸能抑制烟草花叶病毒对离体的枯斑三生烟(Nicotina tabacum cv.samsum NN)叶片的侵染和在离体的普通烟(Nicotina tabacum)叶片内的繁殖,说明在植物中也存在2′-5′寡腺苷酸的作用体系,为植物干扰素的作用机理研究提供了新的依据。     

生物催化氨基酸C—N裂解反应的研究进展

氨基酸脱氨酶能催化系列氨基酸C—N裂解反应生成对应的α 酮酸和氨,是代谢途径及生物催化的重要酶.综述了近年来催化氨基酸C—N裂解反应的5'磷酸吡哆醛介导的苏氨酸脱氨酶、黄素腺嘌呤二核苷酸介导的L氨基酸脱氨酶和L氨基酸氧化酶,以及这些关键酶应用于多酶级联反应中以生产α 羟基酸、α 酮酸、D氨基酸等精细化学品的研究进展.此...     

国外大刊重要论文简介

改变腺苷酸库的结果导致转基因植物 ①淀粉含量和产量增加RegiererB ,FernieAR ,SpringerF ,Perez_MelisA ,LeisseA ,KoehlK ,WillmitzerL ,GeigenbergerP ,KossmannJNatureBiotechnology ,2 0 0 2 ,2 0 :1 2 5 6～ 1 2 60淀粉及其精细加工产品作为人类日常饮食的重要来源。植物合成淀粉主要在质体中进行。研究发现 :增加质体腺苷酸的供应可以有效提高淀粉含量。腺苷酸激酶 (EC2 .7.4.3)主要催化ATP和AMP向ADP的转化 ,因此可以有效地调控质体腺苷酸的水平。采用反义RNA对该酶基因的下游调控对质体各种腺苷酸的量均有影响。借…     

苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达及酶法合成L-苯丙氨酸

利用基因重组技术 ,在大肠杆菌中克隆并表达苯丙氨酸脱氨酶 (PAL) (EC4 .3 .1 .5) ,并应用此酶转化肉桂酸生成L 苯丙氨酸。方法是将欧芹苯丙氨酸脱氨酶cDNA亚克隆到组成型表达载体pMG3 6e启动子P3 2下游 ,以菌落PCR法鉴定插入片段的大小和方向都正确的克隆 ,进而以HPLC检测肉桂酸浓度的方法鉴别重组质粒有催化肉桂酸生成L 苯丙氨酸的酶活力。结果获得能表达PAL酶活性的阳性克隆 ,在pH1 0 ,含 1 .0 %肉桂酸、8.0mol/L氨的转化液中 ,3 0℃反应 2 0h ,肉桂酸重量转化率可达 60 %。该基因工程菌有希望用于工业化生产L 苯丙氨酸。     

蛇足石杉内生真菌产黄青霉菌MT-40中xanthocillin类似物生物合成基因簇的挖掘及鉴定

Xanthocillin具有显著的抗菌活性,结构中含有独特的异腈基。本文通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)内生真菌产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)MT-40基因组的测序分析,利用本地BLAST等生物信息学分析工具挖掘具有合成xanthocillin类似物潜力的基因簇,结合米曲霉(Aspergillus oryzae)NSAR1异源表达技术实现基因簇中关键基因的功能鉴定。结果成功从内生真菌P.chrysogenum MT-40中发现一个合成xanthocillin类似物的生物合成基因簇(命名为for),for基因簇中的关键生物合成基因forB编码的异腈基合成酶可以催化合成2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid,基因forG编码的P450酶可以催化2-formamido-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid的二聚化生成xanthocillin类似物N,N′-(1,4-bis(4-hydroxyphenyl)buta-1,3-diene-2,3-diyl)diformamide。本文研究结果为进一步从真菌中发现xanthocillin类似物提供参考。     

米曲霉尿嘧啶营养缺陷型突变体筛选及转化体系建立

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物，但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核，并且对多种抗性药物具有抗性，导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选标记。尿嘧啶营养缺陷型是米曲霉转化中最常用的一种营养缺陷型标记，其筛选标记基因pyrG编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶为尿嘧啶的前体尿苷合成所必需。本研究以米曲霉3.042为背景，利用紫外线诱变和5-氟乳清酸(5-FOA)胁迫筛选获得5株尿嘧啶营养缺陷型菌株，经DNA测序5株菌株均为pyrG基因不同位点突变，确定为尿嘧啶营养缺陷型。以筛选到的尿嘧啶营养缺陷型菌株为背景，利用农杆菌介导的米曲霉转化系统，成功构建了米曲霉尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌转化体系。     

蛇肌果糖-1,6-二磷酸酯酶的别构部位

比较蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的别构抑制剂AMP和它的类似物对该酶的抑制作用的结果表引,5′-AMP的嘌呤环上6位氨基以及核糖上5′磷酸基团是抑制剂和别构部位结合所必需的。8-BrAMP和5′-AMP具有相似的抑制能力,表明嘌呤环上的咪唑部分对于AMP的抑制作用贡献不大。5′-d-AMP对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的抑制作用比较特殊,按照50%抑制该酶时的抑制剂浓度计算,得到的抑制常数为3×10~(-6)M,其数值和5′-AMP的抑制常数接近。但是当抑制剂浓度增大时所能达到的最大抑制程度只有60%左右。表明5′-dAMP和5′-AMP结合后,对果糖1,6-二磷酸酯酶的催化部位的影响不同,2′羟基和酶的结合可能和别构部位的信号传导到催化部位有关系。被水溶性羰二亚胺修饰的蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶受5′-AMP的抑制作用和5′-dAMP的抑制作用相似,推测这个传导变构部位的信息到催化部位去的基团有可能和羧基有关。     

运动激活AMPK减少海马Aβ沉积的可能机制

淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成的老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)最主要的病理原因之一,其海马内的异常沉积可诱导AD的发病,这与AD动物海马内腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性的降低有关。研究发现,适宜的体育运动能够抑制AD动物海马内Aβ的沉积,但具体机制尚不明确。现综述了近期的研究成果,推测适宜的体育运动可以通过消耗ATP,使AMP水平升高,AMP可激活海马内AMPK,激活了的AMPK可通过上调α-分泌酶表达和下调β-分泌酶表达来减少Aβ的生成,从而起到了预防和缓解AD的作用。     

食源米曲霉菌株的分离及其降解高效氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的特性研究

【目的】通过研究不同食源米曲霉菌株对高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin,β-CP)及其必经代谢产物3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)的降解特性,了解不同菌株的降解共性及差异性,为农副产品和发酵食品的农残减除提供理论基础和食品用安全微生物资源。【方法】以发酵食品为菌源,通过形态学鉴定、ITS测序和菌株产黄曲霉毒素B1 (AFB1)的测定筛选鉴定米曲霉菌株,采用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)对米曲霉模式菌株RIB40 (保藏编号:ATCC 42149)、米曲霉M4 (保藏编号:CGMCC 11645)和鉴定获得的米曲霉菌株的β-CP和3-PBA降解特性进行研究。【结果】鉴定获得15株不产AFB1的食源米曲霉,17株米曲霉在马铃薯液体培养基(PD)中振荡培养5d,对50mg/L的β-CP降解率为19.33%-50.29%不等,检测到降解产物3-PBA,对50 mg/L的3-PBA降解率为45.59%-99.67%不等;分别在添加50 mg/Lβ-CP和3-PBA的无机盐培养基(MM)中振荡培养5 d,米曲霉菌株均未生长,对β-CP和3-PBA无降解;在富集培养基(GM)中振荡培养2 d,对100 mg/L的3-PBA转化或降解率为69.28%-99.58%不等,检测到3-苯氧基苄醇(3-PBlc)和羟基-3-苯氧基苯甲酸(HO-3-PBA)。【结论】食源米曲霉具有共代谢降解β-CP和3-PBA的共性,3-PBA为β-CP降解中间产物,米曲霉对3-PBA普遍具有较高的降解率。在3-PBA降解初期,米曲霉可将其短暂还原生成毒性相对较低的3-PBlc,同时,3-PBA逐渐羟基化生成水溶性更强的HO-3-PBA参与下游降解。