hpt与bar基因作为水稻转基因筛选标记的比较研究

标记基因的选择是影响植物遗传转化和转基因后代筛选成败的关键因素。hpt与bar作为两种常用的水稻转化筛选标记被广泛应用于水稻的转化。为比较两者在实际应用中的效果, 文章首先对比了在潮霉素和除草剂(Bialaphos)两种筛选剂下水稻遗传转化的情况。研究表明, hpt基因的转化筛选体系相对于bar基因在转化效率上提高近两倍, 转化周期提前至少10 d, 且插入基因拷贝数更低。随后, 文章分析了利用潮霉素浸种法在田间筛选转基因水稻的可行性, 研究显示当潮霉素浓度大于167 mg/L时, 可以对以水稻品种kitaake为亲本的转基因材料进行有效筛选, 达到常规除草剂的筛选效果。但与除草剂相比较, 潮霉素的田间筛选成本却处于劣势。文章研究和讨论了hpt和bar基因在遗传转化和后代田间筛选中的优缺点, 并提供了一种利用潮霉素浸种法筛选转基因后代阳性植株的手段, 为将来在水稻转基因研究工作中根据实际需求选择合适的遗传转化、筛选体系提供参考。     

转基因玉米外源基因通过花粉漂移的频率和距离

基因漂移是转基因生物可能引起生态环境安全性问题的主要风险之一,选用美国孟山都公司的转基因抗除草剂玉米GA21进行了外源基因向周边环境遗传漂移的距离和频率的研究,结果表明:转基因玉米的外源基因可以向周边玉米品种进行漂移,其最大漂移频率为45.10%,150m处仍能检测到外源基因的漂移,防止转基因玉米基因向外扩散的最佳途径为设置隔离带,隔离距离以200m以上为好。     

转基因稻及其非转基因亲本对照在间隔种植条件下的转基因漂移

随着转基因技术的迅速发展, 越来越多的转基因作物被培育出来。转基因作物的外源转基因通过花粉传播向非转基因作物的漂移, 会影响非转基因作物品种的种子纯度, 从而可能导致一系列生物安全问题。为了研究转基因栽培水稻(Oryza sativa)中的外源转基因通过花粉介导向非转基因水稻品种逃逸的可能性及其频率, 我们选用3个含双价抗虫基因(Bt/CpTI)的转基因水稻品系及其相对应的非转基因水稻亲本品种(近等基因系)进行了转基因漂移的实验。为了获取在近距离状况下转基因水稻与非转基因水稻品种之间的转基因漂移频率, 采用了转基因与非转基因水稻品种间隔种植的栽培方式, 分别在福建省福州市和海南省三亚市的转基因环境安全实验地进行实验, 并利用潮霉素抗性筛选标记基因来鉴定转基因和非转基因稻的杂种。共检测了从非转基因水稻品种随机收获的70,056颗种子, 以此计算转基因漂移频率。结果表明, 在相邻种植的情况下, 由这3个转基因水稻向对应的非转基因水稻品种的转基因漂移的频率比较低(0.275–0.832％)。如此近距离条件下获得的低转基因漂移频率表明, 对于严格自花授粉的水稻而言, 通过一定的隔离措施, 能有效地降低由花粉介导的转基因漂移导致的非转基因种子混杂。     

人抗凝血酶Ⅲ转基因羊的外源基因漂移风险分析

目的:研究转基因羊发生基因漂移的可能性.方法:利用实时荧光定量PCR技术检测人抗凝血酶Ⅲ转基因羊及与其密切接触的野生型山羊、转乙肝表面抗原基因羊、转β-干扰素转基因羊、狗、鸡和鹅的血样中人抗凝血酶Ⅲ基因的含量.结果:人抗凝血酶Ⅲ转基因只在人抗凝血酶Ⅲ转基因羊血液中检测呈阳性.结论:人抗凝血酶Ⅲ基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移,提示转基因羊对于环境是安全的.     

水稻转基因植株后代中外源基因异常分离的研究

以用农杆菌介导法育成的日本晴等3个品种（系）的转基因水稻为材料,对外源基因的分离情况进行了研究。这几份转基因水稻都携带串联排列的抗虫基因cry1Ab和报告基因gusA等基因,在自交后代中,cry1Ab和gusA协同分离,但阳性植株与阴性植株之比都显著小于3：1,阴性植株显著偏多,以杂合转基因植株（gusA1-)作母本植株,与常规品种（-1－）杂交所得测交F1,阳性植株（＋／－）和阴性植株（－／－）的比例基本符合1：1,在反交时,阴性植株与阳性植株之比显著大于1：1的比例,比较日本晴转基因后代中gusA阳性株与阴性株的结实率发现,前者的结实率显著低于后者,综合上述结果可以看出,携带crylAb等转基因的花粉存在竞争劣势,可能是导致外源基因异常分离的主要原因。     

Bt/CpTI转基因稻及其非转基因亲本对照在间隔种植条件下的转基因漂移

随着转基因技术的迅速发展,越来越多的转基因作物被培育出来。转基因作物的外源转基因通过花粉传播向非转基因作物的漂移,会影响非转基因作物品种的种子纯度,从而可能导致一系列生物安全问题。为了研究转基因栽培水稻(Oryzasativa)中的外源转基因通过花粉介导向非转基因水稻品种逃逸的可能性及其频率,我们选用3个含双价抗虫基因(Bt/CpTI)的转基因水稻品系及其相对应的非转基因水稻亲本品种(近等基因系)进行了转基因漂移的实验。为了获取在近距离状况下转基因水稻与非转基因水稻品种之间的转基因漂移频率,采用了转基因与非转基因水稻品种间隔种植的栽培方式,分别在福建省福州市和海南省三亚市的转基因环境安全实验地进行实验,并利用潮霉素抗性筛选标记基因来鉴定转基因和非转基因稻的杂种。共检测了从非转基因水稻品种随机收获的70,056颗种子,以此计算转基因漂移频率。结果表明,在相邻种植的情况下,由这3个转基因水稻向对应的非转基因水稻品种的转基因漂移的频率比较低(0.275–0.832%)。如此近距离条件下获得的低转基因漂移频率表明,对于严格自花授粉的水稻而言,通过一定的隔离措施,能有效地降低由花粉介导的转基因漂移导致的非转基因种子混杂。     

从无芒稗花粉活力评价其与转基因抗除草剂水稻基因漂移的可能性

为给转基因抗除草剂水稻和稗草间的基因漂移研究提供必要的信息,探寻了无芒稗(Echinochloacrusgalli var.mitis)花粉活力及其测定的最佳方法,并利用该方法测定了无芒稗开花盛期后离体和活体条件下不同时间的花粉活力。结果表明无芒稗开花盛期取样离体条件下花粉活力下降较快,3 h后花粉活力只有5.41％,活体条件下花粉活力下降较慢,3 h后仍有17.31％的花粉有活力。这说明无芒稗花粉在水稻开花时仍有部分保持活力,因而存在潜在的基因漂移可能性。同时用最佳培养基法测定了不同条件处理下(紫外灯照射,反复冻融,黑暗放置)无芒稗花粉活力,结果表明无芒稗花粉在不利环境条件下活力难以保持。     

转基因抗除草剂油菜对十字花科杂草的基因漂移

以转基因抗除草剂油菜Q3为花粉供体材料,油菜远缘杂草为花粉受体材料,在自然传粉和人工辅助授粉条件下研究甘蓝型油菜与十字花科杂草间的基因漂移频率。结果表明,以转基因油菜为父本,十字花科杂草荠菜、碎米荠、播娘蒿、诸葛菜、风花菜、遏蓝菜和菜为母本,杂交高度不亲和,基因漂移率为0 % ,无生态风险,但对野芥菜的基因漂移率高达0 .885 %。野芥菜是我国大部分地区的常见杂草,种类繁多,分布范围广,大面积种植转基因抗除草剂油菜对野生芥菜的基因污染应引起高度重视。     

转基因抗除草剂油菜对近缘作物的基因漂移

以转基因抗除草剂油菜 Q3和 HCN- 19为花粉供体材料 ,油菜近缘作物为花粉受体材料 ,在自然授粉条件下研究甘蓝型油菜与芸薹属近缘作物间的基因漂移频率。结果表明 ,油菜对芸薹属 6个种甘蓝、黑芥、埃芥、芥菜型油菜、白菜型油菜和甘蓝型油菜的基因漂移率分别为 0、0 .0 2 4 %～ 0 .2 4 3%、 0 .0 2 8%～ 0 .0 92 %、 0 .10 9%～ 0 .95 1%、 0 .4 79%～ 0 .879%、 1.2 5 2 %～2 .191%。且基因漂移频率受多种因素影响 ,其中与杂交亲和性、花期同步率、种植面积等高度相关。通过花粉将抗除草剂基因漂移给近缘作物 ,油菜是需要特别关注的作物     

转基因水稻的研究和应用

植物基因工程的兴起,使特定的外源基因引入植物细胞成为可能。水稻转基因研究是国内外植物分子遗传学研究的热点之一。近十几年来,水稻转基因研究已取得显著进展。综述了水稻基因转化的方法、转基因技术在水稻上的应用及外源基因在转基因后代中的遗传表达的研究进展。     

Expression of Rice Stripe Virus Coat Protein Gene in Transgenic Rice Plants

Rice stripe virus (RSV) is a pathogen of rice stripe disease causing great damage to rice. The disease is transmitted by Laodelphax striatellus and three other planthoppers. RSV infects as much as 37 cereals including rice, wheat, maize and results in a significant reduction in yield in epidemic year. In order to develop efficient means of controlling the disease, authors have studied the amino acid composition of RSV coat protein (CP), synthesized and cloned the cDNA to CP, sequenced the full-length CP gene. Having inserted the RSV CP gene into plant expression vector pROK Ⅱ, authors transformed rice suspension culture via microprojectile bombardment and obtained transgenic plants expressing the CP gene. The suspension culture was initiated by inoculating yellowish, compact and embryogenic calli derived from seeds into suspension medium containing proline and maltose. After being cultured at 26℃ in the dark for about half a year, finely-dispersed and embryogenic suspension culture was estabolished. Before bombardment the suspension culture was evently applied onto three-layered filter-paper discs in a petri dish. CaCl2 and spermidine was employed to coat tungsten particle with plasmid DNA. 2.5 μl of coated particle was loaded onto bullet and each dish was bombarded three times. Immediately after being bombarded, the suspensions were cultured in modified N6 medium. 2 days later the suspensions were transferred to the same medium but containing G418, which were subcultured weekly. Being subject to G418 selection for two months, white and fast-growing clones were emerged from the brownish cultures. Green plants regenerated when the resistant calli were transferred to differentiation medium. The regenerated plants were firm enough to grow well in the greenhouse. 10 plants regenerated from G418 resistant calli were tested for their transformed nature by Southern blot using 32P-labelled CP gene as a probe. Among the plants tested, 2 plants showed clearly hy bridizing bands with a molecular weight corresponding to RSV CP gene. Western blot further demonstrated that RSV CP gene was expressed in transgenic rice plants. At present tests on the antiviral effects of transgenic plants by feeding plantphoppers infccted with RSV are being underway.     

转RGSV-SP基因水稻植株的再生

通过农杆菌介导将水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV)编码病害特异蛋白基因sp导入台农67及中花6号品种.经过筛选,再生,获得转化植株.PCR及Southern点杂交分析结果初步表明目的基因片段整合到水稻基因组中.RT-PCR Southern点杂交结果表明目的片段已在植株体内进行了转录.     

转RGSV—SP基因水稻植株的再生

通过农杆菌介导将水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)编码病害特异蛋白基因sp导入台农67及中花6号品种。经过筛选,再生,获得转化植株。PCR及Southern点杂交分析结果初步表明目的基因片段整合到水稻基因组中。RT—PCR Southern点杂交结果表明目的片段已在植株体内进行了转录。     

通过根癌农杆菌介导的共转化获得具有蜡质基因反义片段的转基因水稻

在构建剔除潮霉素抗性基因的反义蜡质基因重组质粒p13W8的基础上,用分别携带p13W8质粒和有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒的根癌农杆菌,在不同处理条件下对粳稻3个品种进行共转化.试验结果显示,共感染混合液中pCAMBIA1300菌液比例高,抗性愈伤组织的转化频率也较高;抗性愈伤组织的PCR检测结果表明,潮霉素抗性基因的阳性检测率为98%,反义蜡质基因的阳性检测率为68%.在105株转基因植株中,反义蜡质基因阳性株为30株,占转基因植株的28.6%.乙酰丁香酮处理组的平均转化频率略高于未处理组;在乙酰丁香酮的各种处理中,直接浸泡愈伤组织的转化频率稍高于其它处理方式.     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控。构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)植物和水稻(OryzasativaL.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因。转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高。这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达。在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

水稻bicoid反义基因转基因植株胚胎发育的形态变化

Bicoid是调控果蝇胚胎极性及以后分节发生过程的重要基因,这一基因编码的蛋白是一种转录调控因子,对一组早期胚胎发育过程中的多齿基因的表达具有调控作用,并被称为形态发生剂。在以前的工作中,从水稻cDNA文库中分离了一个同果蝇bicoid有相当同源性的克隆-Rb24基因（EMBL登录号：AJ2771380）。为进一步了解它在水稻中功能,将Rb的反义基因片段通过农杆菌的介导转入水稻中。通过Gus活性检测和PCR鉴定所获的抗性植株为转基因植株,转基因植株一个很明显的变化就是大约有50%的种子是败育的。通过石蜡切片观察了转基因水稻幼胚的发育情况,结果表明细胞的组织的分化在胚的发育过程中被阻断了。因此Rb基因同控制水稻胚的发育有关。     

Tissue-Dependent Expression of the Rice wx+ Gene Promoter in Transgenic Rice and Petunia

The waxy (wx) locus, which controls the amylose synthesis, isknown to be expressed specifically in the endosperm and pollen.To study the tissue-specific regulation of the wx⁺ gene, weintroduced a fusion gene that consisted of the upstream sequenceof the wx⁺ gene and the gene for rß-glucuronidase(GUS) into cells of rice (Oryza sativa L.) and petunia (Petuniahybrida L.). GUS activity was examined in the regenerated transgenicrice and petunia plants. In transgenic rice, the upstream sequenceof the wx⁺ gene was sufficient to direct the tissue-specificexpression of GUS in the endosperm and pollen, and the controlof expression was quantitative. By contrast, in transgenic petunia,the same fusion gene was expressed in pollen but not in theendosperm. These results suggest that the putative cis-actingelements that direct pollen-specific expression are common toor similar in both monocotyledonous and dicotyledonous plants,whereas ciy-elements responsible for the endosperm-specificexpression of the rice wx⁺ gene do not function in petunia,in which development of the endosperm differs from that in rice. ⁴Present address: Division of Biological Sciences, GraduateSchool of Science, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo, 060Japan     

降低转基因植物外源基因扩散的分子策略

转基因植物可以通过花粉或种子将外源基因转移到其他植物,从而对生态环境造成潜在的危害。如何降低外源基因的扩散已引起了人们的极大关注。目前降低外源基因扩散的方法主要有叶绿体转化、花粉不育、种子不育、闭花受精、无融合生殖、暂时性控制及转基因缓和等。主要对各种方法的原理和优缺点及目前的使用情况进行综述。Abstract: Transgenic plants can transfer foreign genes through pollen or seed to related plant species. This may cause potential harm to ecological environment. How to decrease the gene flow is drawing a growing public attention. The approaches for decreasing the gene flow include chloroplast transformation, pollen sterility, seed sterility, cleistogamy, apomixis, temporal control, and transgenic mitigation. The theoretical basis, advantages and disadvantages, and usage status of these approaches are presented in this review.