苦荞过敏蛋白TB22的原核表达及纯化

为了确定苦荞主要过敏原蛋白TB22的抗原决定簇,揭示其致敏机制,为以后的分子改造及育种改良打下基础,需要在体外微生物体系中获得大量的纯化蛋白。以pQE31为表达载体,M15为表达菌株,使用IPTG诱导,在37℃获得了以包涵体形式存在的表达产物。经WesternBlotting检测,证明表达条带N端带有Histidinetag。使用8molL尿素初步纯化后,目的蛋白含量达到40%以上。进一步HitrapChelatingHP亲和纯化,表达蛋白的纯度达到90%以上。建立了适合重组TB22纯化的基本方法,得到了纯化的包涵体,为抗TB22抗体的制备及其抗原决定簇的研究奠定了基础。     

苦荞FtPCS基因克隆、表达及酶活性初步分析

该研究以Pb~(2+)诱导的苦荞(Fagopyrum tataricum)叶片转录组数据为基础,通过RT-PCR克隆,获得苦荞植物络合素合酶(Phytochelatins,PCs)基因(FtPCS);采用无缝克隆构建原核表达载体pET28a-PCS,并通过反向-HPLC结合DTNB[5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)]柱后衍生的方法,对纯化的FtPCS重组蛋白在Pb~(2+)存在条件下的催化活性进行初步分析,为进一步揭示FtPCS基因在苦荞重金属富集和解毒过程中的机制奠定基础。结果表明:苦荞FtPCS基因组序列全长5 456bp,包括8个外显子和7个内含子;FtPCS基因ORF序列全长1 485bp,编码494个氨基酸,预测分子量为55.10kDa。可溶性分析表明,苦荞FtPCS基因在E.coli BL21Star(DE3)中以包涵体的形式表达,采用梯度透析复性并结合钴离子螯合层析的方法获得纯化的FtPCS重组蛋白,复性的FtPCS蛋白具有催化GSH生成PC化合物的活性,而且低浓度的Pb~(2+)对其催化活性具有激活作用。     

一种苦荞主要过敏原基因cDNA的克隆及序列分析

为了获得苦荞中主要过敏原的cDNA和由此推导的蛋白质序列 ,分析其结构特点 ,以苦荞幼根根尖为材料 ,提取总RNA并反转录mRNA为cDNA第一链 .通过RT PCR、3′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得一种苦荞主要过敏蛋白基因的cDNA片段 (GenBank登录号为AY0 4 4918) .该cDNA片段由 76 8bp组成 ,包括 3′端非编码区 180个bp ,开放阅读框 5 88bp .可编码一个由 195个氨基酸残基组成的功能蛋白及一个终止密码 .苦荞主要过敏原基因与甜荞 2 2kD过敏蛋白、豆球类蛋白的核苷酸序列分别有 95 %和 93%的同源性 .其推导的氨基酸序列与甜荞球蛋白、刀豆蛋白、甜橙柠檬素分别有 93%、83%和 5 7%的同源性 .该过敏蛋白 183～ 188位氨基酸残基KEEEKE在多数不同过敏原中均存在 ,推测可能为其中的抗原决定簇序列     

苦荞全基因组11S种子储藏蛋白基因的鉴定及表达分析

以苦荞（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn）全基因组数据为平台,采用生物信息学方法,挖掘出9个11S种子储藏蛋白基因,并对其定位、蛋白结构、系统发育及表达模式进行了分析。结果表明,苦荞9个11S种子储藏蛋白基因编码的蛋白长度为189~914 aa,等电点位于5.18~9.82之间,分子量为21.27~103.33 kD;定位分析结果显示,这些成员位于苦荞基因组的6条连锁群上（Megascaffold2/5以及scaffold77/344/395/861）;序列比对分析发现,除了1个11S种子储藏蛋白sample1_00009513-RA具有1个cupin保守结构域外,其余8个都含有2个cupin结构域,并且在cupin保守结构域中,苦荞和拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh）共有14个保守的氨基酸残基;蛋白结构预测表明,苦荞11S种子储藏蛋白的结构具有2种类型;苦荞与其它6个物种[拟南芥、花生（Arachis hypogaea Linn.）、大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）、杏仁（Armeniaca vulgaris Lam.）、胡桃（Juglans regia L.）和芝麻（Sesamum indicum Linn.）]11S种子储藏蛋白以及苦荞过敏蛋白（TBb和TBt）系统发育分析结果表明,这些蛋白可以分为3类,共具有4对旁系同源蛋白和3对直系同源蛋白;与已报道的苦荞过敏性储藏蛋白以及其它5个物种（花生、大豆、杏仁、胡桃和芝麻）的11S过敏蛋白比较发现,5个11S种子储藏蛋白（sample1_00013128-RA、sample1_00013130-RA、sample1_00021677-RA、sample1_00021668-RA和sample1_00021674-RA）与苦荞2个过敏蛋白的同源性较高,同时它们与胡桃11S过敏蛋白的同源性最高,但尚需进一步实验来确定这5个成员是否为食物过敏原;RNA-Seq转录组数据显示,4个基因（sample1_00018411-RA、sample1_00026786-RA、sample1_00021674-RA、sample1_00022718-RA）在2种荞麦属植物的灌浆期种子中表达水平较高,且在‘大苦1号’中的表达水平要高于‘大甜1号’。     

生物信息学分析人类病毒互作广谱蛋白的特征

了解病毒与人类蛋白的相互作用对于理解病毒感染宿主机制非常重要,已有研究主要集中在病毒如何进入宿主细胞、复制、扩散和致病等方向上,对病毒与人类蛋白的相互作用模式缺乏系统研究。本研究中我们构建了迄今为止最全面的病毒与人类之间的蛋白相互作用网络,涵盖来自218种病毒的1 674种蛋白与来自人类的13 724种蛋白的108 832对蛋白相互作用;在此基础上鉴定出109个至少与12种病毒家族存在蛋白相互作用的人类蛋白,定义为人类的病毒互作广谱蛋白（简称广谱蛋白）;从结构、功能、蛋白互作网络以及组织表达量等四个方面系统地分析了广谱蛋白的特征,发现广谱蛋白相较于非广谱蛋白以及其它人类蛋白具有更密集的转角结构、更多的结构域、更高的网络中心度和组织表达量,表明它们可能在病毒感染宿主过程中起着重要作用。本研究有助于加深我们对于病毒感染人类模式的理解,同时也对进一步探究病毒与疾病之间的关联有一定的帮助。     

家蚕化学感受蛋白CSP16的表达及结合特性分析

【目的】化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在昆虫化学信号的感受识别和生长发育调节等生理过程具有重要作用。本研究旨在探索CSP16在家蚕Bombyx mori中的功能。【方法】利用RT-q PCR分析csp16在家蚕不同发育时期和不同组织的表达特征,用原核表达系统对家蚕CSP16进行表达纯化,并通过荧光结合实验检测该蛋白与不同配体化合物的结合特性。【结果】RT-q PCR结果表明,csp16在家蚕1-5龄幼虫中呈规律性表达,各龄期眠蚕中表达量最高,5龄第3天幼虫中主要表达于头、表皮、精巢和卵巢等。蜕皮激素(20E)处理后csp16在不同龄期幼虫和5龄幼虫不同组织中的表达量上调。纯化后CSP16的荧光结合实验表明,CSP16与醇类、酯类、醛类、酚类和苯环类等化合物的亲和力都较弱。【结论】csp16在家蚕不同龄期幼虫眠蚕中表达量最高,蜕皮激素使csp16在家蚕取食幼虫中的表达量出现上调,提示其可能参与家蚕幼虫的蜕皮过程。     

猪δ冠状病毒核衣壳蛋白互作的蛋白鉴定及分析

初步筛选与鉴定PDCoV N蛋白的宿主互作蛋白.利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)和LC-MS/MS质谱技术筛选出PDCoVN蛋白的宿主互作蛋白,并进行生物信息学分析,再利用免疫共沉淀进行鉴定.通过免疫共沉淀产物的SDS-PAGE分析发现在40 kD和100 kD左右有明显的差异蛋白条带,通过质谱筛选到了68个与PDCoVN蛋白互作的宿主蛋白,并做了GO、COG和KEGG注释,挑选出2个候选互作蛋白,经过免疫共沉淀验证,PDCoVN蛋白与TUBB2B存在互作关系.该研究为进一步探索PDCoV N蛋白在病毒感染细胞时的作用提供了新方向.     

CsPPR和CsCPN60-like在茶树白化叶片中的表达分析及互作蛋白验证

本课题组前期通过转录组筛选出2个与‘白鸡冠’茶树（Camellia sinensis）叶片白化相关的基因（CSS0013384和CSS0036305）,为探明CSS0013384和CSS0036305在白化茶树中的表达模式与其互作蛋白,以‘白鸡冠’茶树叶片为材料,克隆CSS0013384和CSS0036305 cDNA全长序列,利用生物信息学、酵母单杂交和酵母双杂交,分析其蛋白理化性质、系统进化树、染色体定位、基因结构、蛋白结构、蛋白调控与互作网络和基因表达模式。生物信息学分析结果表明,CSS0013384和CSS0036305分别属于三角状五肽蛋白（pentatricopeptide repeat protein, PPR）和伴侣蛋白（chaperone, CPN60-like）家族,其蛋白质编码区（coding sequence, CDS）长度为1 893 bp和1 752 bp,编码氨基酸个数为631和575,蛋白质质量为71.87 kD和60.79 kD,等电点为8.93和6.21。亚细胞定位预测结果表明,CSS0013384定位于叶绿体,CSS0036305定位于线粒体。通过...     

SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-32a+并在大肠杆菌中表达,应用Western-blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联板来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应.这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性.将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性.用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体.实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的.提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究.     

SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-F32a＋并在大肠杆菌中表达,应用Western—blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联卡反来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应。这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性。将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性。用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体。实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的。提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究。     

重组苦荞麦过敏蛋白TBa的原核表达及其免疫活性鉴定

TBa ［tartary buckwheat allergen］是苦荞麦中的一种主要过敏蛋白.根据长度为585 bp 的TBacDNA序列,以pET-28a为表达载体并选择合适的酶切位点合成上、下游引物,采用基因克隆技术构建重组表达载体pET-28a-TBa.进一步将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3) 中进行表达.从而获得以包涵体形式存在的TBa目的蛋白.该目的蛋白经Ni ²⁺ -NTA琼脂糖柱亲和纯化及SDS-PAGE分析显示, 纯度达到95% 以上.用透析复性的方法将目的蛋白重折叠,其复性产率可达到约68%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.ELISA检测表明,通过基因重组及表达获得的重组苦荞麦过敏蛋白,与天然苦荞种子中的该蛋白具有相似的免疫学活性,与荞麦过敏病人血清中的IgE有特异性的结合.     

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶的原核表达与多克隆抗体制备

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶。该研究以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆苦荞DFR编码基因,并将其连接到表达载体pET47b上,转化获得苦荞DFR编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物,用亲和层析方法纯化蛋白,制备苦荞DFR多克隆抗体。RT-PCR技术获得了苦荞DFR编码基因的开放阅读框,重组表达载体经PCR和测序鉴定,表明表达载体构建成功,SDS-PAGE分析表达产物分别以可溶和不可溶的形式高效表达,亲和层析纯化得到融合蛋白,Western blotting显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的苦荞DFR蛋白在苦荞种子灌浆期中大量表达。苦荞DFR编码基因的原核表达与多克隆抗体的制备,为进一步开展DFR编码基因功能的研究奠定了基础。     

苦荞突变体库构建与突变体中芦丁合成相关基因表达分析

苦荞是重要的小杂粮作物之一,营养物质丰富,是天然芦丁的重要来源。突破苦荞育种难题,创制苦荞新种质是目前研究的重要方面。本试验利用甲基磺酸乙酯(EMS)构建了黑丰1号苦荞突变体库,明确了当EMS浓度为1.2%时,诱变效果较好。通过对M1突变株表型观察统计,共获得叶色、叶型、株型、粒型变异单株102株,突变率为3.85%;高效液相色谱技术(HPLC)测定1000株M3材料,获得高芦丁含量突变株系2个和低芦丁突变体株系5个;qRT-PCR对芦丁含量突变体株系中芦丁代谢关键酶基因(CHS、F3H、4CL、FLS、UFGT)进行表达量分析,发现不同株系中上述基因的表达量与芦丁含量相关性不明显,但个别基因如FtFLS基因表达量在高芦丁含量突变体中达到对照的4.55倍。通过突变体的筛选丰富了苦荞基因资源,创新了苦荞新种质,也为苦荞芦丁代谢的分子基础研究提供了材料保证与技术支持。     

苦荞黄酮-3-羟化酶截短体的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备苦荞黄酮-3-羟化酶的多克隆抗体,该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞黄酮-3-羟化酶基因截短体(truncated Flavanone-3-hydroxylase,TrF3 H)序列为基础,采用PCR扩增F3 H的截短序列编码区(TrF3 H),构建了原核表达载体pET47b-TrF3 H,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行诱导表达,将经钴离子螯合层析柱纯化后的目的蛋白切胶回收后制备了高效价的多克隆抗体。结果表明:pET47b-TrF3 H在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中以包涵体的形式高效表达。蛋白质印迹显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的黄酮-3-羟化酶蛋白在苦荞的未成熟种子中大量表达。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨F3H在苦荞中功能奠定了基础。     

苦荞NAC转录因子FtNAC17的鉴定及表达分析

植物特有的NAC转录因子参与植物生长发育和逆境响应。研究苦荞中NAC转录因子在非生物胁迫中的应答,为阐明基因功能提供理论依据。以苦荞为试验材料,克隆一个NAC家族基因,对其进行生物信息学分析。通过荧光定量PCR技术检测该基因在干旱、低温、盐、茉莉酸甲酯、脱落酸和赤霉素胁迫时的响应情况。该基因编码272个氨基酸,将其命名为FtNAC17,GenBank登录号为MT641452。基因结构分析表明,FtNAC17由2个外显子和1个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明,FtNAC17蛋白与拟南芥ANAC002亲缘关系最近,属于NAC转录因子家族中同一亚组。FtNAC17对干旱、低温、盐等非生物胁迫均有不同程度的响应。     

基于PAL基因序列的地方苦荞品种遗传多样性分析

苦荞在中国具有广泛的栽培种植地区,长时间演化形成了丰富的遗传多样性。为了研究和利用苦荞资源,以国内北方苦荞产区(内蒙古、青海、陕西、山西、甘肃)、西南苦荞产区(西藏、四川、贵州、云南)、国内其他地方品种(江西、安徽、湖北、湖南、广西)及国外品种(尼泊尔)共计67份苦荞材料为研究对象,PCR扩增其PAL基因并测序。在此基础上分析苦荞的遗传多样性,并采用NJ法(neighbor-joining)对67份苦荞材料构建系统进化树。结果表明,供试的67份苦荞材料的PAL基因序列长度为2011 bp,其中,变异位点为160个,占序列总长度的7.9%,简约信息位点为33个,占序列总长度的1.64%,突变的类型主要是碱基的转换与颠换,高变异位点均集中在外显子2的N端。不同来源的苦荞材料间的遗传距离分布于0.002~0.016之间,来源于中国四川组的苦荞材料种内平均遗传距离最大(0.016),中国内蒙古组的最小(0.002)。中国四川地区的材料与其他地区来源的材料间的遗传距离位于0.010~0.016之间,而其他地区间的遗传距离为0.004~0.013。67份苦荞材料的平均π值和θ值分别为0.0034和0.0143。其中,中国四川材料的π值为0.0148。基于PAL基因序列构建的NJ进化树中,67份苦荞材料分为7个类群,分类与地理来源无关。仅中国西藏来源的5份材料聚集为一类,说明PAL基因序列较为稳定,多数材料间变化差异较小。中国四川地区的苦荞材料具有丰富的遗传多样性,中国西藏地区的某一材料中有较多的SNP位点,推测中国西藏的部分材料可能存在突变的热点区,预示着PAL基因新的突变位点区域。     

苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化

高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作。该实验以苦荞(Fagopyrum tartaricum)品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响。结果表明:酶解液组成为1.5%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.5mol/L甘露醇+20mmol/L MES+20mmol/L KCl+10mmol/L CaCl2+0.1%牛血清白蛋白,以第5~7片真叶为材料,用胶带纸撕去叶片下表皮后,25℃黑暗酶解4h,以900r/min离心收集,可以获得高质量的原生质体,原生质体产量可达6×106个/g,活力达到90%以上;用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率,以分离纯化的苦荞叶肉细胞原生质体为受体,将双荧光素酶报告基因载体与其混合后,在终浓度为20%PEG4000介导下,黑暗转化20min,可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶,证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中。研究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础。     

顶空气相色谱法检测苦荞麦总黄酮提取物的有机溶剂残留量

为控制使用AB-8型大孔树脂后苦荞麦总黄酮提取物的质量,采用顶空气相色谱法,对提取物中正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、乙苯和苯乙烯等8种残留物进行检测。精密度RSD均小于6％,峰面积与浓度均有良好的线性关系,最低检测限为0．016—0．0640g／mL,回收率均符合要求。试验结果表明,方法稳定、操作简便、准确可靠,适用于使用AB-8型大孔树脂后苦荞麦总黄酮提取物中有机溶剂残留量的检测。     

苦荞SSR引物开发及其在遗传多样性分析中的应用

苦荞在中国已经成为广受欢迎的健康食品。本研究通过选择性扩增微卫星序列、体外重组扩增产物和构建SSR富集文库,开发出了一种简便的重组微卫星引物设计方法。通过这种方法,设计合成500对SSR引物,在苦荞上的有效性约50%,多态率达10.8%,PIC平均值为0.3600。利用其中的28对SSR引物,在苦荞核心种质中检测出等位基因85个,每位点的等位基因数为2～5个,平均3.0个。不同地理来源的苦荞种质资源的Shannon-Weaver多样性指数为0.3633～0.6671,来自云南、四川和西藏的苦荞材料不但遗传多样性丰富,而且亲缘关系较近,进一步证实苦荞起源于中国西南部。本研究证明重组微卫星引物设计方法开发的引物对苦荞非常有效,将有助于促进苦荞种质资源遗传多样性、有用基因发掘和分子标记辅助育种研究。