响应盐胁迫调控的露地菊miR398a的克隆及功能研究

miRNAs在非生物胁迫中起着重要的作用。通过前期对露地菊Small RNA高通量测序数据测得到miR398a成熟体和前体序列,命名为cgr-miR398a和cgr-MIR398a。序列对比显示,cgr-miR398a与其他植物中已经鉴定的miR398a序列高度保守;利用前期露地菊降解组数据获得miR398a预测的靶基因,cgr-miR398a根和叶中的靶基因共有18个,其中有铜/锌超氧化物歧化酶（CSD2）、铜伴侣蛋白（CCS）、类A20/AN1-l锌指家族蛋白（SAP8）等与抗性相关的基因。qPCR结果显示盐胁迫下露地菊miR398a及靶基因在不同组织部位的表达水平存在显著的负相关性。为探究cgr-miR398a响应盐胁迫的功能,克隆cgr-MIR398a并构建过表达载体转化拟南芥。结果表明,拟南芥中过表达cgr-MIR398a降低了盐胁迫下种子发芽率以及成苗期的抗盐性,说明cgr-miR398a在拟南芥响应盐胁迫中起着负调控作用。这为进一步研究露地菊mi398a的功能和露地菊的抗盐机理奠定了基础。     

miR398在植物逆境胁迫应答中的作用

MicroRNA (miRNA)是一类新型的调控基因表达的小分子RNA, 它作为基因表达的负调控因子, 在转录后水平调节靶基因的表达。miRNA参与调控植物的生长发育, 并在多种非生物与生物胁迫响应中发挥重要作用。miR398是第一个被报道的受氧化胁迫负调控的miRNA。它通过负调控其靶基因Cu/Zn过氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase, CSD)的表达, 在多种逆境胁迫响应中扮演重要角色, 如调节铜代谢平衡, 应答重金属、蔗糖、臭氧等非生物胁迫, 以及参与应答生物胁迫等。文章综述了miR398在多种逆境胁迫响应中重要的调节作用及miR398自身的转录调控。     

光皮桦miR164及其靶基因NAC1在低氮胁迫中的表达分析

氮是植物生长发育所必需的大量营养元素,植物缺氮后严重影响地上部分生物量的积累,因此,揭示植物如何抵抗或适应低氮胁迫的分子机制具有重要意义。杨树(Populus tremula × P. alba)NAC1(NAM, ATAF, CUC 1)基因位于调控网络上游,在低氮环境下调控下游关键基因的表达,进而调控根系生长以抵抗低氮胁迫。本文以光皮桦(Betula luminifera)G49-3无性系组培苗为材料,探讨了miR164及其靶基因NAC1对低氮胁迫的响应。通过RACE技术克隆了光皮桦NAC1基因(GenBank登录号：KT900889),全长1497 bp,编码358个氨基酸,N端具有高度保守的NAM结构域;运用5′-RACE验证了NAC1为miR164靶基因,切割位点在第10和11位碱基之间;采用qRT-PCR分析miR164与靶基因NAC1在低氮胁迫时的表达模式,发现miR164表达在根中的低氮处理前期(4 d)受到抑制,而后升高,而茎叶中表达模式与根不同;靶基因NAC1与miR164表达水平呈负相关,且在恢复实验组(重新添加全营养液)中,根中miR164表达上升,NAC1显示出相应的表达变化,暗示miR164及其靶基因NAC1可能在低氮胁迫响应中发挥调控功能。本研究结果有助于揭示miR164对NAC1在低氮胁迫响应中转录后水平的分子调控机制,为进一步研究miR164-NAC1在低氮胁迫响应中的功能提供有价值的信息。     

过表达抗miR98的OsmCSD2基因提高水稻的重金属抗性

CSD（Cu／Zn superoxide dismutases）基因在拟南芥中参与多种胁迫应答,而miR398是CSD基因响应胁迫的原因。此处,我们成功克隆出了水稻的OsCSD2基因,并根据密码子的兼并性,突变了miR398作用的位点,但不改变其氨基酸序列,得到新的抗miR398的OsmCSD2,构建过表达载体并转入水稻中。对阳性转基因株系的分子鉴定表明,过表达植株的OsmCSD2基因获得了高表达。在重金属铜胁迫下,转基因株系表现出良好的抗逆性,H2O2含量显著低于野生型。     

胡杨无性系幼苗响应盐胁迫的miRNA表达差异研究

植物miRNA在调控基因表达、细胞周期、生物体发育、抗逆等方面起重要作用。为研究胡杨(Populus euphratica Oliv.)的耐盐机制,以1年生胡杨无性系幼苗为材料,构建具有空间代表性的盐胁迫胡杨cDNA文库,利用二代测序技术测定NaCl胁迫下和正常培养条件下胡杨叶和根miRNA表达情况。结果表明,不同的miRNA之间表达量存在明显差异,表达丰度最高的miRNA有miR156、miR157、miR165、miR166和miR167等,合计占总表达量的90%以上。胡杨根部存在特异表达的miRNA,在整个耐盐调控机制中发挥着生理调节、分子调控和信号传导等极为重要的作用。盐处理样品中发现大量响应盐胁迫的miRNA,对这些转录因子进行靶基因预测和注释后,发现很多盐胁迫响应的miRNA与NAC和SPL等重要转录因子家族相关,与前人的结论一致,另外还发现许多miRNA的调控对象是ATP酶和激素响应因子。     

基于mRNA-Seq的沙漠植物花花柴干旱胁迫表达谱分析

以抗逆性较强的荒漠植物花花柴为材料,利用数字基因表达谱技术对用质量百分数20%的PEG溶液处理0、4、8、12和24 h后的花花柴幼苗的m RNA-Seq测序结果进行分析。结果表明,花花柴幼苗叶部在不同处理时间均上调表达的基因有122个,下调表达的基因54个,根部在不同处理时间均上调表达的基因73个,下调表达的基因79个。利用q RT-PCR和RT-PCR对可能与花花柴耐旱相关的6个差异表达基因进行了验证,发现其表达模式与表达谱结果一致,推测这些基因可能均与花花柴响应干旱胁迫相关。本研究为耐旱相关基因的发掘及应用提供了基础。     

马蔺根系响应Cd胁迫的miRNA高通量测序分析

为了解Cd胁迫下马蔺﹝Iris lactea var. chinensis ( Fisch.) Koidz.〕根系miRNA的表达模式,采用高通量测序法对100μmol·L-1 Cd胁迫0(CK)和24 h(Cd)后马蔺根系的sRNA文库(分别为CK和Cd文库)进行分析,筛选出显著差异表达的miRNA,并对这些miRNA的靶基因功能进行预测;在此基础上,采用qRT-PCR技术对部分miRNA及其靶基因的表达模式进行验证。结果表明：在CK和Cd文库中,未注释的sRNA序列较多,分别占各自sRNA特异序列总数的86.4%和80.5%;在已注释的sRNA序列中,miRNA所占比例最低(分别为0.3%和0.5%),而rRNA所占比例最高(分别为9.4%和11.8%);2个文库中的sRNA长度主要为21~24 nt,且均以21 nt为最多。从Cd胁迫下马蔺根系sRNA中共筛选出32个显著差异表达的miRNA,其中20个miRNA表达量下调(分别属于miR165、miR166、miR167、miR168、miR390和miR396家族),12个miRNA表达量上调。功能预测结果表明：这些miRNA靶基因的功能主要集中在生物学过程、细胞组分和分子功能3个方面;而从KEGG通路富集分析看,富集在核糖体、氨基酸生物合成和碳代谢3个通路上的差异表达miRNA的靶基因数分别为122、88和82个。 qRT-PCR验证结果表明：在CK和Cd文库间,11个差异表达miRNA及8个靶基因的相对表达量均有显著差异(P<0.05);其中,11个miRNA相对表达量的上调和下调趋势与上述筛选结果一致,并且miRNA相对表达量上调时,其靶基因的相对表达量下调,反之亦然,说明Cd胁迫条件下马蔺根系的miRNA负调控其靶基因的表达,并且这些靶基因主要参与编码转录因子、HD-ZIP蛋白和信号蛋白等过程。     

毛竹miR398和miR408的克隆及其表达分析

为了解毛竹(Phyllostachys edulis)中miR398和miR408的表达情况,从毛竹叶片中分离了二者的前体序列,并用实时定量PCR技术对其表达模式进行了研究。结果表明,毛竹中miR398和miR408前体序列ped-MIR398和ped-MIR408长度分别为83 bp和92 bp,二者均能形成稳定的茎环结构,其中成熟miRNA序列(ped-miR398和ped-miR408)均位于5′端臂上。ped-miR398和ped-miR408均为组成型表达,在毛竹叶中表达量最高。强光、蔗糖和GA3处理后,叶片中ped-miR398与pedmiR408的表达量均上调;CuSO_4和ABA处理后,叶片中二者的表达量均下调;黑暗、NaCl和4℃处理后,前者表达量上调,后者表达量下调。因此,ped-miR398与ped-miR408在毛竹适应逆境胁迫过程中可能发挥着不同的调控作用。     

龙眼DCL家族基因的启动子分析及时空表达

为了解龙眼DCL基因的功能,该试验对龙眼基因组数据提取的DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4基因序列进行启动子顺式作用元件及其受miRNA调控的分析;并以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究了DlDCLs不同基因成员在非生物胁迫和外源激素处理下的表达情况。结果显示:(1)龙眼DCL基因启动子中除了TATA和CAAT外,还具有大量的光反应元件、激素应答元件、胁迫响应元件、组织特异性调控元件及植物生长发育相关的顺式调控元件,提示龙眼DCL基因启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导。(2)对调控龙眼DCL基因的miRNA进行筛选,结果显示DlDCL1受miR162和miR1024调控,DlDCL4受miR390和miR396调控。(3)实时荧光定量PCR显示,在一定浓度范围内,外源激素GA3、ABA和ETH均能下调DlDCLs基因的表达,而高浓度ETH处理则显著上调DlDCLs的表达。(4)高浓度蔗糖(6%)处理时DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4显著上调表达,而低浓度(0.1%)处理时DlDCL1显著上调表达;不同温度处理下,DlDCL1在34℃时显著上升,DlDCL3随着温度的提高相对表达量逐渐减低;而DlDCL2和DlDCL4表达量差异不明显;NaCl胁迫处理下,DlDCLs在1h处理时表达量下调,但在其他不同时间点则上调表达。研究表明,龙眼DCL基因在外源激素及非生物胁迫处理下,并非是简单的一对一响应,而是存在较为复杂的响应机制。     

水稻病程相关蛋白质在逆境胁迫下的表达研究

植物病程相关(PR)基因一般在病原物侵染过程中受诱导发生转录上调．目前有证据提示植物PR基因在非生物逆境胁迫下也发生转录变化,但其蛋白质的表达变化情况还鲜有报道．为了解水稻PR蛋白质在逆境胁迫下的表达特征,本文采用免疫印迹技术(Western blotting,WB)调查了8个PR蛋白质在冷、热、旱、淹和盐等5种胁迫下的表达谱．结果表明：在冷胁迫下PR8表达上调,在热胁迫下PR1a、PR3、PR5和PR16表达下调;在旱胁迫下PR1a、PR2和PR8表达上调,而PR5 和PR16表达下调,在淹胁迫下PR1、PR2和PR15表达上调,PR1a、PR3、PR5和PR8表达下调;在盐胁迫下PR2和PR3表达上调,而PR1a、PR5、PR8和PR16表达下调．另外,对这些PR 基因的上游启动子区进行分析,发现存在与胁迫响应相关的调控元件,其中脱落酸反应元件(ABRE)、TC-rich repeats和HSE的出现频率较高．这些蛋白质表达数据进一步佐证了PR蛋白在逆境胁迫反应中发挥着重要且不尽相同的作用．     

盐穗木HcDmc1基因的克隆和表达分析

根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,克隆获得盐穗木DNA损伤修复基因的cDNA序列,其开放阅读框1 035bp,编码344个氨基酸,命名为HcDmc1。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有RecA蛋白家族典型的保守结构域;统进化树分析显示HcDmc1为独立的分支;亚细胞定位于细胞质,为无信号肽、不跨膜的稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,盐穗木在100mmol/L NaCl胁迫7d后,同化枝中HcDmc1基因表达迅速上调并达到最大值,约为对照组的6.58倍;在700mmol/L NaCl胁迫14d后根中HcDmc1基因表达最高,约为对照的1.79倍。研究表明,HcDmc1基因表达受盐胁迫诱导。     

冰菜盐胁迫下的转录组分析

为了解冰菜(Mesembryanthemum crystallinum)叶片抗盐相关基因组学,利用Illumina Hi-seq TM2500高通量测序技术研究冰菜叶片在400 mmol L~(–1) NaCl胁迫下转录组基因的差异表达。结果表明,从400 mmol L~(–1) NaCl胁迫和对照的冰菜叶片中共获得13.01 Gb Clean data,Q30碱基均大于90.08%。共获得123个差异表达基因(DEGs),包括73个上调基因,50个下调基因,其中功能注释的基因有96个。根据Unigene库序列进行GO、COG和KEGG注释,筛选出8个与抗盐性相关差异表达基因,植物激素代谢相关基因,脱落酸8'-羟基化酶、吲哚-3-乙酰酸酰胺合成酶和茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白基因均下调表达,生长素响应蛋白、细胞分裂素合酶基因则上调表达,糖代谢相关基因棉子糖合成酶基因上调表达,质膜H+-ATPase基因上调表达,脱水蛋白基因下调表达。这为冰菜耐盐基因组学和分子生物学的研究奠定基础。     

盐穗木HcPEAMT基因的克隆及表达分析

依据盐穗木编码PEAMT的EST序列设计引物,通过快速扩增cDNA末端技术,获得盐穗木磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)全长cDNA,命名为HcPEAMT。序列分析表明HcPEAMT基因开放阅读框为1 482bp,编码494个氨基酸,推测分子量为56.3kD,理论等电点为5.51。保守结构域分析表明,HcPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认HcPEAMT与盐生植物盐角草的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,盐胁迫3h时,盐穗木同化枝和根中HcPEAMT基因的表达迅速上调并达到最大值,分别为对照的4.3倍和6.7倍。脱落酸(ABA)胁迫3h时,同化枝中HcPEAMT的表达量达到最高,而根中HcPEAMT的表达在12h才达到最高,表达量分别为对照的2.6和2.5倍。研究结果表明,HcPEAMT基因表达受盐胁迫的强烈诱导,也受ABA胁迫的诱导。该研究结果有助于阐明HcPEAMT基因表达与植物抗逆性的相关性。     

白化菠萝蜜茎2个蛋白激酶和4个转录因子家族分析

为探究蛋白激酶(PKs)和转录因子(TFs)在白化菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)幼苗茎次生生长中的表达变化,基于转录组数据对其差异表达基因(DEGs)进行预测及分类,并对挑选出的2个PKs和4个TFs家族构建系统进化树。结果表明,胞质类受体激酶(RLCK)-VIII家族的DEGs上下调表达各4个,亮氨酸富集重复类受体激酶(LRR-RLK)-X家族Xa和Xb-2分支中的DEGs均下调表达,Xb-1中的均上调,TCP家族的20个DEGs中有15个上调表达,zf-HD和GRF家族中的大多数DEGs上调表达,Alfin-like家族中的DEGs均下调表达。因此,这表明6个家族可能在菠萝蜜茎的次生生长过程和应对非生物胁迫中发挥重要作用。     

马尾松R2R3-MYB基因特征及进化和表达分析

MYB类转录因子在植物生长发育、代谢、应答生物胁迫和非生物胁迫的响应等生物过程发挥重要作用。为探究马尾松R2R3-MYB基因结构及功能,该研究以转录组数据为研究区域,从中筛选获得了17个马尾松R2R3-MYB基因,利用生物信息学对基因进行理化性质、系统进化树等分析,同时利用荧光定量PCR技术分析基因的组织特异性以及在花发育时期和非生物胁迫下的表达模式。结果表明：(1)17个PmMYBs亚细胞定位于细胞核,均无跨膜结构,且均含有Motif1、Motif2保守基序。系统发育进化树将马尾松PmMYBs划分为9个亚家族,且与火炬松、白云杉等裸子针叶植物关系较近。(2)17个基因均属于组成型表达,但在不同组织的表达量不同;所有基因均参与了花发育和非生物胁迫,不同基因在花发育不同时期的表达存在差异,有7个基因可能参与了雌雄性状转变;大部分基因响应非生物胁迫上调表达,但响应胁迫的时间存在差异;少数基因在胁迫中下调表达,尤其是PmMYB11基因在所有胁迫中均明显下调表达。该研究较系统地分析了马尾松R2R3-MYB基因的结构特征、系统进化及其在花发育时期和非生物胁迫下的表达模式,为深入探究马尾松R2R3...     

SMB基因与拟南芥细胞脱分化

应用Affymetrix基因芯片技术研究脱分化过程的全基因组表达情况,分析拟南芥叶柄细胞在脱分化过程中的差异表达基因。结果显示:(1)脱分化叶柄有4 222个基因表现出2倍或以上的表达差异,其中1 684个基因表达上调,2 538个基因表达下调。(2)半定量RT-PCR对部分差异表达基因进行验证,进一步筛选出参与拟南芥脱分化候选基因SMB(SOMBRERO)。(3)实时PCR结果表明,野生型叶柄诱导脱分化时,SMB基因表达量随着诱导时间延长而逐渐增加。(4)SMB基因功能缺失突变体smb-3经CIM诱导很难形成愈伤组织;在激素诱导不同时间段,smb-3叶柄没有明显脱分化现象,SMB基因缺失造成拟南芥叶柄脱分化障碍。研究表明,SMB基因参与拟南芥叶柄细胞脱分化过程。     

盐胁迫下盐穗木甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达与亚细胞定位分析

为研究盐胁迫下植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的作用机制,该研究利用RACE技术,从藜科盐生植物盐穗木中克隆获得1 381bp GAPDH基因(HcGAPDH)全长cDNA序列,其开放阅读框(ORF)编码314氨基酸。序列分析表明,HcGAPDH属于胞质GAPDH家族成员。实时定量PCR结果显示,HcGAPDH的转录水平受盐胁迫和ABA上调。通过荧光共聚焦显微技术,检测到绿色荧光蛋白标记的HcGAPDH在正常情况下定位于细胞质中,盐胁迫可促使其从细胞质转移至细胞核中,此过程与细胞内碳水化合物代谢的信号途径不具有相关性。研究表明,HcGAPDH通过细胞质和细胞核之间的信号传导在植物盐胁迫中发挥一定作用,为进一步揭示盐穗木耐盐分子机制奠定了一定基础。     

互花米草NHX2基因的克隆与功能鉴定

NHX2属于CPA1基因家族,编码Na~+/H~+逆向转运蛋白,控制液泡膜中活性K~+的摄取,同时调节气孔的关闭。该研究以耐盐植物互花米草为材料,采用PCR技术克隆NHX2基因,并将其转入拟南芥进行相关功能鉴定。结果显示:(1)成功克隆获得互花米草NHX2基因CDS序列(1 602 bp),命名为SaNHX2,该基因编码533个氨基酸,SaNHX2蛋白的分子量约为58.65 kD,定位于细胞核和细胞膜,表明SaNHX2基因可能发挥转录调控的功能。(2) qRT-PCR结果显示,在ABA、NaCl和干旱胁迫处理下,互花米草叶和根中SaNHX2基因的表达量均上调。(3)为进一步鉴定其功能,成功构建植物表达载体,将SaNHX2基因转入拟南芥;经RT-PCR检测结果显示,SaNHX2基因在转基因植株中过表达;高盐胁迫处理后,转SaNHX2基因拟南芥的主根长度、叶绿素总量和相关胁迫应答基因表达量均高于转空载拟南芥,表明转SaNHX2基因拟南芥的耐盐能力显著增强。研究表明,SaNHX2基因可能在盐胁迫调节机制中发挥调控作用,可作为改良农作物耐盐的重要候选基因。     

Biotic and abiotic stress down-regulate miR398 expression in Arabidopsis

MicroRNA398 targets two Cu/Zn superoxide dismutases (CSD1 and CSD2) in higher plants. Previous investigations revealed both decreased miR398 expression during high Cu²⁺ or paraquat stress and increased expression under low Cu²⁺ or high sucrose in the growth medium. Here, we show that additional abiotic stresses such as ozone and salinity also affect miR398 levels. Ozone fumigation decreased miR398 levels that were gradually restored to normal levels after relieved from the stress. Furthermore, miR398 levels decreased in Arabidopsis leaves infiltrated with avirulent strains of Pseudomonas syringae pv. tomato, Pst DC3000 (avrRpm1 or avrRpt2) but not the virulent strain Pst DC3000. To our knowledge, miR398 is the first miRNA shown to be down-regulated in response to biotic stress (P. syringae). CSD1, but not CSD2, mRNA levels were negatively correlated with miR398 levels during ozone, salinity and biotic stress, suggesting that CSD2 regulation is not strictly under miR398 control during diverse stresses. Overall, this study further establishes a link between oxidative stress and miR398 in Arabidopsis.     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的nce-miR-23928及其靶基因表达谱

【背景】东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞而导致的微孢子虫病给养蜂业造成严重损失。【目的】检测东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-23928及其靶基因在侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为深入探究nce-miR-23928在东方蜜蜂微孢子虫侵染中的功能及调控机制提供依据。【方法】通过RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-23928的靶基因。使用BLAST工具将上述靶基因比对到基因本体论(geneontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)、Nr和Swiss-Prot数据库以获得相应注释。采用实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR,RT-qPCR)技术检测nce-miR-23928及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的相对表达量。【结果】相较于接种后1 d (1 day post infection, 1 dpi),nce-...