限制和修饰酶基因Lla BⅢ的克隆及分析

pJW566是从丹麦乳酪生产菌株Lactococcus lactis subsp.cremoris W56中分离到的,一个22.4kb,具有限制和修饰作用的质粒,内切酶ClaⅠ和pJW566不完全消化,所得片段与来自于质粒pVC5的氯霉素抗性基因连接得到一个携带有完整限制和修饰酶基因的质粒pJK1。基因亚克隆分析发现该基因位于约5kb的Sph0Ⅰ-Hin dⅢDNA片段上。序列分析表明该片段包含一个4572bp的开放阅读框架、编码一个由1576／1584个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为Lla BⅢ。蛋白质同源性查询发现在该蛋白的N－末端有7个保守区域,与R／M系统Ⅰ型和Ⅲ型内切酶有较高同源性,在蛋白的中间区域有4个代表N^6-腺苷酰甲基转移酶的特征序列,而蛋白的C－末端不同于任何已知蛋白。这种具有限制、修饰和可能的DNA识别作用的多功能蛋白,可能是一新的R／M系统。     

限制和修饰酶基因LlaBⅢ的克隆及分析

Pjw5 66是从丹麦乳酪生产菌株Lactococcuslactissubsp .cremorisW5 6中分离到的 ,一个 2 2 4kb、具有限制和修饰作用的质粒。内切酶ClaⅠ对Pjw5 66不完全消化 ,所得片段与来自于质粒Pvc5的氯霉素抗性基因连接得到一个携带有完整限制和修饰酶基因的质粒pJK1。基因亚克隆分析发现该基因位于约 5kb的SphⅠ HindⅢDNA片段上。序列分析表明该片段包含一个 4572bp的开放阅读框架 ,编码一个由 1576/1584个氨基酸残基组成的蛋白质 ,该基因命名为LlaBⅢ。蛋白质同源性查询发现在该蛋白的N 末端有 7个保守区域 ,与R M系统Ⅰ型和Ⅲ型内切酶有较高同源性 ,在蛋白的中间区域有 4个代表N⁶-腺苷酰甲基转移酶的特征序列 ,而蛋白的C 末端不同于任何已知蛋白。这种具有限制、修饰和可能的DNA识别作用的多功能蛋白 ,可能是一新的R M系统。     

揭秘细菌的限制-修饰系统--诺贝尔奖得主阿贝尔自传

以自传的方式,结合个人的成长历程,生动地叙述了揭秘限制-修饰这一重要遗传学现象的探索历程．介绍了科学研究的环境与背景,还特别提到了科研与教学、与社会责任、与家庭生活等之间的关系。     

利用弗氏链霉菌的修饰系统克服吸水链霉菌的限制性障碍——发展吸水链霉菌转

用来自变铅青链霉菌TK24的质粒PIJ702（tsr,mel^ )转化吸水链霉菌应城奕种10－22的原生质体,未能得到转化子,但改用来自弗氏链霉菌ATCC 10745的pIJ702转化10－22原生质体却得到了转化子,转化频率约10^3-10^4转化子／微克DNA,在这些转化子中,只有约1／1000是黑色菌落（mel^ ),绝大部分为白色菌落（mel^-),分别挑出黑色,白色2种菌落,只有从前者能提出电泳可见的PIJ702质粒带。2种菌落的质粒提取物,均能转化TK24原生质体并正常表达黑色素,在非选择性条件下,从10－22（PIJ702）黑色菌落的群体中,获得了少数白色菌落,经证明它们是10－22的宿主突变体,这些突变体的PIJ702转化子出现均一的黑菌落。     

限制和修饰系统的克隆及同源性研究

迄今已有１２４种完全和５４种不完全的限制和修饰系统基因成功地基隆于大肠杆菌,９０多种限制和修饰系统基因被测序。本综述了细菌内克隆限制和修饰基因的方法,并从分子遗传水平上讨论了它们的进化关系。     

限制和修饰系统LlaBⅢ在构建抗噬菌体菌株中的作用

限制和修饰(restriction and modification,R/M)系统是指由限制性内切酶和甲基化酶组成的单亚基或多亚基复合酶系统,两者通常成对出现,具有相同的DNA识别位点,其作用相反.R/M系统在原核生物中普遍存在,在保护细胞免遭外源病毒侵害方面具有重要作用[1].     

用无细胞克隆系统进行特异DNA扩增的技术—PCR

作为分子生物学基石之一的分子克隆技术,是一系列技术的总称,包括目的基因的提纯,选择有自主复制能力的载体DNA,选用不同的限制性内切酶,构建新的重组DNA,导入受体细胞,重组DNA的转化,转化后遗传物质和性状的转移及重新组合,重组DNA的纯化扩增等。该系列技术的操作相当复杂繁琐且耗时长。如何从极微量的生物材料中简便快速地得到大量特定的基因,或是在众多复杂的生物基因DNA中,     

BstNI同功酶限制—修饰系统基因的表达检测和定位分析

鉴定了Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１和ＪＭ１１０的部分遗传标记,作为受体菌分别用于ＢｓｔＮＩ同功酶限制－修饰系统中限制性内切酶（Ｒ）基因和甲基化酶（Ｍ）基因表达的检测。用外切酶Ⅲ单向删切含Ｒ－Ｍ基因的ＤＮＡ片段,获得２３个缺失突变亚克隆。通过检测各亚克隆表达的Ｒ酶和Ｍ酶活性,将Ｒ和Ｍ基因分别定位在距克隆位点ＰｓｔＩ和０．２→１．４ｋｂ和１．５→３．３ｋｂ范围内。分析表明：该系统属于Ⅱ类限制－修饰系统,两     

结核分枝杆菌限制修饰系统的研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是引起结核病的病原菌,其自身进化所产生的特异性和非特异性免疫机制能够抵御外来DNA(如噬菌体)的入侵,其中细菌自身的限制修饰系统(restriction-modification system,R-M系统)则是阻碍噬菌体侵染的重要原因.细菌的R...     

牦牛Myf-5基因的克隆测序及其系统进化研究

本研究对牦牛(九龙牦牛)的生肌决定因子5(Myf-5)基因进行了T-A克隆测序和分析,并与多个物种的相应基因编码区核苷酸序列、氨基酸序列进行了比对分析,构建了物种间的系统进化树.结果 表明:①牦牛的Myf-5基因大小为3313 bp,由3个外显子和2个内含子组成,与普通牛等9个物种比较,在基因大小上有较大的差异,但外显子和内含子的组成一致.②牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛、人、恒河猴、黑猩猩、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼等物种间Myf-5基因编码区的核苷酸序列同源性较高,其中,牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛间的同源性最高,达98.4%以上,说明Myf-5基因编码区核苷酸序列在动物物种间具有较高的保守性.③牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛、黑猩猩、恒河猴、人、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼等物种间Myf-5基因编码蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性,保守性强,这一结果与编码区核苷酸序列的比对结果基本一致.④根据核苷酸序列,用NJ法构建的牦牛、大额牛、瘤牛、水牛、普通牛、人、恒河猴、黑猩猩、狗、家鼠、软体贝壳、鸡、斑马鱼等13个物种的分子系统进化树显示:牦牛、普通牛、瘤牛、水牛和大额牛在较近的亲缘关系下聚为一大类,人、黑猩猩和恒河猴聚为另一大类,然后这两类再和其他物种相聚.这一分类结果与各物种的动物学分类结果和血液蛋白、mtDNA水平上的聚类结果基本一致,支持牦牛、普通牛和瘤牛3个物种间不应该是属间或亚属间关系,而应是同一属下的不同种,将牦牛、普通牛和瘤牛划分在同一个属--牛属(Bos),而将水牛划分在另一个单独的属的观点.同时也显示该基因序列适合用于动物学分类.     

镜像克隆系统:DNA重组技术的新进展

镜像克隆系统是近几年新发展起来的一种DNA重组技术,它突破了传统重组限制酶切及连接的繁琐和费时,利用重组酶使外源基因快速、方便地进行亚克隆和表达。本阐述了镜像克隆系统的结构、作用原理及特点。     

吉首蒲儿根的繁育系统及克隆构型

吉首蒲儿根是分布于武陵山区的稀有植物,通过观察其花部特征和开花进程,检测花粉活力、柱头可授性以及套袋实验对其繁育系统进行了研究,并根据地下根茎构筑型、形态特征和地下根茎间的夹角分析了其克隆构型。结果显示:(1)吉首蒲儿根种群花期一般为45~50d,有不明显的二次开花现象,单株花期为10~22d,单个头状花序花期约为3~5d;散粉时柱头高于花药筒,形成花冠、药筒、柱头三者在空间上的分离。(2)吉首蒲儿根的杂交指数为5,P/O值为3 188,繁育类型属于专性异交,异花授粉为主,部分自交亲和,需要传粉者。(3)吉首蒲儿根地上平均含有3.61个分株和4.74个根茎数,根茎间的分枝角度以30°为主,地下根茎构筑型归属于密集型,根状茎断裂是由于组织破碎引起的。研究认为,为适应特殊的峡谷生境,吉首蒲儿根形成了独特的适应策略,先以克隆繁殖来占据生境中的有利地位,后通过"集中开花模式"、雌雄异熟、产生大量花粉等方式来提高异交率,以获得高质量的种子来拓展生境。     

珠芽蓼种群克隆多样性及克隆结构的初步研究

珠芽蓼(Polygonum viviparum)是青藏高原东缘广泛分布的克隆植物,具有有性和无性(根状茎和珠芽)两种生殖方式。该研究采用RAPD技术对分布于不同海拔的珠芽蓼7个自然种群进行了克隆结构和克隆多样性(是单克隆种群还是多克隆种群)以及克隆多样性与海拔因子之间的相关性研究,为了解高山克隆植物对环境的适应性策略及揭示克隆植物的繁殖和分布特点提供科学依据。研究结果表明:1)采用13条RAPD引物对珠芽蓼7个种群共140个样本进行扩增分析,共扩增到117个位点,其中多态性位点84个,多态位点百分率PPL达到71.79%,检测到43个基因型,且全部为局限型基因型;2)与Ellstrand和Roose(1987)总结的克隆植物的克隆多样性平均值相比(PD=0.17,D=0.62),珠芽蓼种群克隆多样性水平稍高,Simpson指数平均为0.639,基因型比率PD平均为0.307;3)克隆结构分析表明,珠芽蓼种群内克隆之间的镶嵌明显,这可能与珠芽蓼过渡型的克隆构型有关。研究中珠芽蓼种群的构型有游击型、密集型以及这两者之间的过渡类型;4)采用SPSS软件对珠芽蓼种群的克隆多样性与海拔高度进行相关性分析,结果显示它们之间并无明显的相关性。     

后生遗传修饰及其对动物克隆的影响

近年来,不断有新的哺乳动物和两栖类动物被成功克隆,但这并不能掩盖克隆效率过低和克隆动物异常的现实,为了解决这一问题,人们对克隆机理进行了大量研究。高度分化的体细胞核在去核的卵质中去分化和再程序化不完全是导致动物克隆失败的主要原因,而去分化和再程序化不完全主要是由于基因组去甲基化不充分和过早再甲基化引起克隆胚中甲基化水平比正常胚中偏高所至,这可引起一些重要基因的异常表达,尤其是印记基因。这些机制的研究对提高克隆效率有着重要意义。     

艾纳香野生种群克隆多样性及克隆结构研究

艾纳香是具有克隆生长习性的多年生宿根性草本植物,其广布于中国南部,为了更有效地保护和合理利用艾纳香资源,本文利用RAPD分子标记技术,对4个野生艾纳香种群进行了克隆结构和克隆多样性(单克隆种群或多克隆种群)进行了初步研究。结果表明:(1)10对10bp随机引物共检测到70条谱带,其中多态带为60条,占85.71%,检测到64个基因型,且全部为局限基因型;(2)与Ellstrand Roose(1987)总结的克隆多样性平均值(PD=0.17,D=0.62)相比艾纳香的种群克隆多样性水平稍高,Simpson指数平均为0.973,基因型比率PD平均为0.800;(3)遗传一致度和遗传距离分析表明,4个艾纳香野生种群被分成两组,一组是海南的所有种群,另外一组是云南类群。     

Bax基因cDNA的分子克隆研究

细胞编程死亡（ｐｒｏｇｒａｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ）是细胞生理性死亡的一种主要形式。Ｂａｘ具有抑制细胞编程死亡的作用。本研究采用ＰＣＲ方法,从人肿瘤细胞ＨＬ—６０ｃＤＮＡ文库中扩增出若干个ｂａｘｃＤＮＡ片段,然后将它们分别与ＰＧＥＭ—Ｔ测序质粒载体连接,并转化到大肠杆菌ＪＭ１０９中去。用蓝／白法筛选重组菌落,经酶切分析及ＰＣＲ鉴定,获得了插入片段大小约为０．４ｋｂ及１．１ｋｂ的ＢａｘｃＤＮＡ重组质粒ＰＢａｘｌ和ｐＢａｘ２。这些片段的测序及表达工作正在进行之中。     

鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6．5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT—PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F／HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmBI将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基插入突变成功,F／HN基因区域碱基突变均得以纠正。以上cDNA克隆的修饰与替换为该毒株的反向遗传研究打下了基础。