荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析

采用包埋法提取荷斯坦奶牛瘤胃微生物大片段总DNA,纯化后脉冲场电泳回收大小为36～48 kb,与pcc2FOS vector连接,转染至大肠埃希菌EPI 300宿主细胞,构建瘤胃微生物Fosmid基因组文库.对文库进行鉴定,该文库平均插入片段大小约35 kb,共保存30 000个克隆,空载体率小于2%,库容达1 050 Mb.     

温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选

【目的】本研究旨在通过非培养手段构建和筛选宏基因组文库,以求找到新型的杀线虫蛋白酶基因。【方法】采用密度梯度离心法提取和纯化温室土壤微生物总DNA,经平末端、连接、包装、转染后,构建宏基因组Fosmid文库,同时,以脱脂奶为底物,以根结线虫为靶标,对文库进行功能初筛。【结果】该文库库容31008个克隆,平均插入片段36.5kb,包含1.13Gbp的微生物基因组信息,适合大规模的微生物功能基因筛选,通过功能初筛,筛选到1个含杀线虫蛋白酶基因的Fosmid克隆(pro12)。进一步构建和筛选出亚克隆(espro124a5),通过对基因结构进行了初步分析发现:espro124a5是一种分泌型胞外蛋白酶,与来自于Maricaulis maris MCS10(accession no.YP_756822at NCBI)的丝氨酸蛋白酶S15仅有45%的同源性,是一种新型的丝氨酸蛋白酶,有其保守的催化三元组:Asp469、His541和Ser348。【结论】密度梯度离心法提取到的DNA纯度高、片段长,完全能满足构建宏基因组Fosmid文库的要求;同时,构建的宏基因组Fosmid文库库容大,有利于我们从中筛选其他的微生物基因资源。     

利用高效的大片段DNA回收方法改良Fosmid文库的构建

外源DNA插入片段为40 kb左右的Fosmid文库在基因组学研究中有广泛的应用,但长期以来,40 kb外源片段的分离与纯化依赖于传统的切胶并电洗脱至透析袋的方法,难以得到足够量的DNA片段,极大降低Fosmid文库构建的成功率。通过改进全自动核酸/蛋白质回收系统SageELF的操作流程,建立一种简单、便捷、高效地回收40 kb左右DNA片段的方法,并用其成功地构建高质量的Fosmid文库。从文库中随机挑选的25个单克隆,经过测序及酶切分析,发现该文库中插入的DNA片段大小为37.9±5.2 kb。以上结果表明,利用改良的操作方法回收40 kb基因组DNA,操作简捷、高效,片段大小精准;另外,用该DNA片段构建的Fosmid文库,插入片段比较集中,有利于后续的基因组学分析。     

牙菌斑培养菌群宏基因组文库构建及抗生素耐药基因筛选

[目的]构建牙菌斑培养菌群宏基因组文库,筛选牙菌斑生物膜中细菌的抗生素耐药基因.[方法]采集20例无龋健康人的集合牙菌斑并进行厌氧培养.提取牙菌斑培养菌群宏基因组构建Fosmid文库.用卡那霉素、四环素及氨苄西林对文库进行筛选,并对筛选到的抗性Fosmid克隆进行末端测序、亚克隆构建、亚克隆测序和序列分析.[结果]构建了牙菌斑培养菌群宏基因组Fosmid文库,插入片段长度在36-48 kb间约有15 120个克隆,插入片段长度小于36 kb的约有3 360个克隆.筛选获得一个氨基糖苷类双功能修饰酶AacA-AphD基因、一个核糖体保护蛋白型四环素耐药基因tet (M)及一个C家族β-内酰胺酶基因.[结论]证实了可以通过构建宏基因组文库的方法来筛选牙菌斑培养菌群中的抗生素耐药基因.     

大腹圆蛛Fosmid文库的构建及MaSp基因筛选方法的探讨

介绍了构建大腹圆蛛Fosmid基因组文库及牵引丝蛋白(MaSp)基因克隆筛选的全过程.采用改良CTAB法提取大片段基因组DNA,通过自主构建的电洗脱核酸回收装置分离回收30～40kbDNA片段,经补平磷酸化、与pCC2FOS载体连接、体外包装和转染EPI300TM-T1R,首次构建了无偏向性的大腹圆蛛Fosmid文库,其滴度为4.5×105cfu/mL,覆盖基因组倍数为10.以α-32P标记寡核苷酸探针对文库进行初步筛选,获得含MaSp基因的12个阳性克隆.该文库符合Fosmid文库的品质要求,为进一步筛选并研究大腹圆蛛MaSp基因序列奠定了基础.     

海绵宏基因组文库构建及抗菌肽功能基因的初步筛选

宏基因组文库技术是利用未培养微生物基因资源的有效途径。成功构建澳大利亚厚皮海绵的Fosmid宏基因组文库,插入片段平均大小为36.8kb。利用建立的宏基因组文库,采用PCR技术初步筛选到具有编码抗菌肽的功能基因。这是我国首次尝试构建海绵宏基因组文库,对于今后开发利用海绵丰富的基因资源具有重要的意义。     

山羊瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析

从山羊瘤胃液中提取混合微生物DNA,经BamHI部分酶切得到50kb～800kb的DNA片段后,将其连接到pCCIBAC载体上,转化E．coliEPI300,建立山羊瘤胃微生物BAC文库。经RFLP鉴定分析,该文库12672个克隆,平均插入片段为6lkb。该文库的构建为后续新型基因的筛选提供了材料,为进一步研究山羊瘤胃微生物奠定了基础。     

武夷菌素产生菌Fosmid文库的构建及文库探针的获得

以不吸水链霉菌武夷变种CK-15为材料,提取基因组DNA,经Sau 3A Ⅰ部分酶切后回收35-40 kb之间的片段,连接到pCC1FOS载体上,经过包装转染涂布后构建得到了CK-15基因组的Fosmid文库,文库的滴度为8.8×105CFU/mL.随机挑取16个阳性克隆,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切电泳分析,样品插入片段平均长度大于35 kb,插入率为100%,符合构建文库的要求.根据多氧霉素、尼克霉素生物合成基因及大环内酯类聚酮合成酶基因(PKS)设计特异性引物,以基因组为模板进行PCR扩增,筛选特异性引物探针.结果用大环内酯类聚酮合成酶基因设计引物扩增出1 693 bp的片段经Blast比对其与大环内酯类抗生素生物合成基因相似性为95%以上.武夷菌素产生菌CK-15 Fosmid文库的构建及文库探针的获得,为武夷菌素生物合成基因的克隆奠定了基础.     

新疆细毛羊2倍基因组BAC文库PCR筛选系统的构建与使用

本研究所构建的BAC文库覆盖了8倍新疆细毛羊的基因组,平均插入片段的大小为133kb,同时文库92．5%的克隆插入片段大于100kb,而且有部分克隆甚至大于300kb,假定绵羊的基因组含有3×10~6kb,根据文库的平均插入片段大小为133kb,从文库筛选到目的片段的概率为98．208%。为了验证文库有较好的覆盖率,构建了2倍基因组文库PCR筛选系统,并对位于新疆细毛羊20号染色体MHC基因邻近区段的DMB_EX2、MCMA36、CP73和BM1258 4个分子标记进行了筛选,得到的平均阳性克隆数为1．5个,从筛选结果来看,这与文库插入片段估计的8倍基因组覆盖率相当接近并且没有偏向,这使得本文库成为研究绵羊的功能基因、位置克隆和完善基因组物理图谱的极为有用的资源。     

荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组BAC文库的构建与分析

采用未培养技术和脉冲场电泳技术直接从瘤胃微生物提取到大小在2Mb左右混合微生物DNA,经HindⅢ不完全酶切获得50～100kbDNA片段,将其连接在pCC1BAC载体上,转化E.coliEPI300,得到瘤胃微生物BAC文库,经对文库的鉴定分析,该文库的平均插入片段54.5kb,空载体率小于2%,库容837Mb,共保存15360个克隆。通过对该文库进行部分酶活性筛选,获得具有淀粉酶活性的克隆16个;纤维素酶活性的克隆26个,而且能降解纤维素的克隆中25个呈现多酶活性。这些结果表明该文库具有重要研究价值。