高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸（GLA）作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3.5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱（GC-MS）联用分析表明高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达

以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析,荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达,建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法。在此基础上,以高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因,构建重组质粒pRH2304MAD6,将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明,高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中,进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明,该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸,占细胞总脂肪酸的4.35%,但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

卷枝毛霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

为获得产高γ—亚麻酸的酿酒酵母工程菌株,应用RT—PCR技术,从卷枝毛霉中扩增出△^6—脂肪酸脱氢酶基因,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2．0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYES412,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母缺陷型菌株INVScl中,在SC—ura合成培养基中筛选到转化酵母,在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过气相色谱对转化酵母进行脂肪酸色谱分析,结果表明：γ—亚麻酸占总脂肪的50．07％。迄今为止,这是国内外△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母表达量最高的报道。     

少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

Δ^6-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ^6-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ^6-肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因（RAD6）亚克隆到表达载体pPIC3．5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱-质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16：1、C17：1、C18：1、亚油酸和α-亚麻酸在△6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因的功能。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（GLA,C18：3△^6,9,12）是由△^6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸（LA,C18：2△^9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△^6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△^6-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生r-亚麻酸,从深黄被孢霉中克隆的△^6-脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pB1121连接,构建了重组质粒pBMICL-6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导人到栽培大豆吉林35、吉林43、吉林47、绥农10、绥农14和黑农37等品种中,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导人并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析,结果表明△。-脂肪酸脱氢酶基因获得表达,产生了r-亚麻酸,其含量最高可达27．067％,这是国内外深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中表达的首次报道。     

少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

△6-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶.在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码△6-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的△6-脂肪酸脱氢酶基因.把少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达.提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱-质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16:1、C17:1、C18:1、亚油酸和α-亚麻酸在△6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性.此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平.综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析△6-脂肪酸脱氢酶基因的功能.     

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）As 3.38△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与酵母表达

通过气相色谱法(GC)快速分析8种真菌的脂肪酸成分,发现匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)具有较高的γ-亚麻酸含量,利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列,其中开放阅读框为1380bp,编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构:N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构;把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0上,构建重组表达载体pYRnD6D,并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明,该序列在酵母中获得了表达,表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性,能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。     

△12-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

把高山被孢霉(Mortierella alpina)和深黄被孢霉(Monierella isabellina)的△^12-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET21a中,获得重组表达载体pMACL12和pMICL12,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌B121(DE3)中。筛选阳性克隆进行培养,然后分离其细胞膜蛋白,并构建体外表达体系,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱(GC)分析表明,分别有17．87％和17．60％的油酸转化为亚油酸。     

高山被孢霉△5脱饱和酶基因的分离与验证

花生四烯酸（arachidonic acid）是人体的必需脂防酸,具有独特的生物活性。△5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6（Mortierella alpina）中通过RT—PCR分离了可能的编码△5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有△5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b。结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱（GC—MS）分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出△5脱饱和酶基因。     

少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌△^6-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR,获得一个593 bp的cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3’和5’序列,从而得到全长为1482bp的cDNA序列。序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1377bp、编码458个氨基酸的开放阅读框,所编码蛋白质的大小为52kD。与报道的△^6-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的N-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区。该序列为一个新的编码△^6-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列RAD6亚克隆到表达载体pYES2．0,构建重组表达载体pYRAD6,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱／质谱(GC-MS)分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的酶具有△^6-脂肪酸脱氢酶活性,能将外源性的底物亚油酸转化为γ-亚麻酸,γ-亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的3．85％。     

莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达与活性分析

采用RT-PCR方法克隆到莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因lyd(l)5,与毕赤酵母表达载体pPIC3.5K连接,电击法转化毕赤酵母GS115.转化子经高浓度G418筛选出高抗性重组子,经PCR鉴定目的基因已整合入毕赤酵母基因组中.甲醇诱导表达,RT-PCR检测表明莱茵表藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中得到了表达;毕赤酵母总脂肪酸甲酯经气相色谱(GC)分析结果显示亚油酸的含量明显降低,而α-亚麻酸的含量有所提高.     

转译起始密码子周边序列的改变对△^6-脂肪酸脱氢酶基因表达的影响

将少根根霉中△^6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)的起始密码子周边序列作适当的修改,并把修改后获得的片段(RAD6-1)亚克隆到表达载体pYES2．0,构建重组表达载体pYRAD6-1。经测序验证,把pYRAD6-1转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达分析,同时以空载体pYES2．0和出发序列所构建的pYRAD6作为对照。通过气相色谱(GC)和气相色谱,质谱(GC-MS)分析表明,在pYRAD6和pYRAD6-1转化的酿酒酵母中生成γ-亚麻酸,而pYES2．0中没有检测到。其中,pYRAD6-1转化的酿酒酵母γ-亚麻酸表达量占细胞总脂肪酸含量的5．23％,而对照pYRAD6转化的酿酒酵母中表达量只占2．64％。     

高山被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因转化大豆的研究

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因导入栽培大豆吉林43和黑龙37品种中。经农杆菌浸染和共培养后,在含50mg/L卡那霉素的选择培养基上连续筛选,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因中组中。通过GC-MS对大豆种子进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了γ-亚麻酸,其含量最高可达18.23%。     

深黄被孢霉M6—22△^6—脂肪酸脱氨酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术,从含有深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的重组粒pTMICI6中,扩增出1.38kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵 母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6, 用酶酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl中,在SC－Ura合成培养基中,选择到酵母工程株YMID6,在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体,通过GC－MS对酶母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析,结果表明,γ－亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的8．69%.     

少根根霉Δ_-~6脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达(英文)

Δ6- 脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ6- 脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α- 亚麻酸在Δ6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的功能。     

高山被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC16266总DNA中扩增出大小为1374bp和1947bp的两条特异片段,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为573bp的内含子和两条分别为197bp和828bp的外显子,推导的氨基酸二级结构分析表明,该基因有两个长的跨膜疏水区和3个组氨酸保守区,分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区,Ⅲ区的序列设计引物,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交,证明在其基因组中确实存在两个△^6-脂肪酸脱氢酶基因,其中一个基因含有内含子,把不含有内含子的核基因MAGL6-1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2.0中,转化到酿酒酵母INVSc1中,对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析,检测到了γ-亚麻酸,说明克隆的D6D基因MAGL6-1能在酿酒酵母中进行功能性表达。     

高山被孢霉ATCC16266Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是形成γ-亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMACL6中,酶切出14kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC-Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC-MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6%的γ-亚麻酸。这是迄今为止,国内外Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。