酵母的分子生物学鉴定

酵母种类繁多,与人类的关系极其密切,但目前由于研究方法的不同,对于酵母的分类还存在着不同的分类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定,既可以有效防止食品腐化变质,又可以增加经济效益,同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。对常用的核糖体DNA鉴定法、DNA指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时PCR和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。     

酵母单杂交的原理与实例

许多诱导型基因的表达,都受特定的转录因子和顺式元件调控。要阐明各种信号传递途径与基因表达调控的机理,克隆和鉴定转录因子是关键。近年来酵母单杂交方法被广泛应用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子,本文以拟南芥DREB转录因子的克隆为例,介绍酵母单杂交方法的原理和具体应用。     

酵母单杂交的原理与应用实例

许多诱导型基因的表达,都受特定的转录因子和顺式元件调控。要阐明各种信号传递途径与基因表达调控的机理,克隆和鉴定转录因子是关键。近年来酵母单杂交方法被广泛应用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子,本文以拟南芥DREB转录因子的克隆为例,介绍酵母单杂交方法的原理和具体应用 。     

酿酒酵母感受态细胞的低温保存及酵母菌落PCR-快速筛选鉴定

异源蛋白在酵母中的表达涉及到大量重组子的筛选鉴定.以直接煮沸2～5 min后的酵母菌落水悬浮液为模板,建立了酵母克隆的PCR快速筛选方法.介绍了PCR反应中减少引物二聚体、提高反应特异性及－80℃低温保存酿酒酵母感受态细胞等技巧.     

利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白

【目的】筛选鉴定西花蓟马Franiklinella ocicdentalis体内与番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)NSs蛋白互作的介体因子。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白;进行序列分析鉴定后,将捕获的蛋白与NSs基因回转到酵母细胞,利用营养缺陷型培养基鉴定蛋白互作情况。再利用GST Pull-down技术验证TZSV NSs与鉴定出的西花蓟马蛋白的体外互作关系。【结果】构建了TZSV NSs的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-NSs,确定了诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性,并且无自激活活性。序列分析发现与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白为类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC)。酵母回转实验显示TZSV NSs与西花蓟马VDAC在酵母细胞内存在特异性互作。GST Pull-down结果表明TZSV NSs与西花蓟马VDAC在体外存在相互作用。【结论】通过酵母双杂交和GST Pull-down技术,分别在酵母细胞内和体外证实了TZSV NSs和西花蓟马VDAC存在特异性互作。这些结果有助于揭示西花蓟马VDAC蛋白调控西花蓟马持久传毒的机制,为虫传病毒病的防治提供理论基础。     

酵母菌杂交育种——Ⅲ.酵母菌麦芽糖发酵等效异位基因系的遗传分析

用啤酒酵母及卡尔斯伯酵母研究麦芽糖发酵等效异位基因,对啤酒酵母与薛氏酵母的杂种后代进行一系列杂交,结果证明啤酒酵母含有3个等效异位基因MALA、MALB及MALC基因(暂定名,因未与标准MAL基因鉴定),而薛氏酵母不含任一MAL基因,故为隐性菌株。 在卡尔斯伯酵母与球形酵母杂交试验中,发现卡尔斯伯酵母只含有1个MAL6基因,证实了Winge等人的工作。 所有这4个麦芽糖发酵基因都是互相独立的不连锁的基因。     

以分子生物学鉴定结果为“金标准”评估Rapid ID Yeast Plus及API20C AUX对酵母样真菌的鉴定效能

目的 以分子生物学方法为“金标准”对两种商品化酵母样真菌鉴定产品Rapid ID Yeast Plus（简称RapIDYST）及API20C AUX（简称API20C）的鉴定效能进行评估.方法 从2010年中国医院侵袭性真菌感染监测网菌株库中筛选酵母样真菌25种,共计194株.其中,包含临床最常见的5种酵母样真菌（白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、新生隐球菌）共130株,占研究总菌株数的67.0％.所有菌株已经过分子生物学方法准确鉴定至种水平.菌株复苏分纯后,严格按照产品操作指南,平行进行RapID YST和API20C鉴定.结果 所研究菌株中,有181株（18种）在RapID YST鉴定菌种数据库中,所有在库菌株种及复合体鉴定正确率为87.8％（159/181）.相比,API鉴定菌种库包含菌株174株（18种）,在库菌株种及复合体鉴定正确率为92.0％ （160/174）.RapID YST与API20C对于5种临床常见的酵母样真菌的种鉴定正确率分别为93.1％和97.1％.对于库外菌株,RapID YST的鉴定错误率分别为23.1％（3/13）,相比API20C的鉴定错误率为60.0％ （12/20）.综合此次评估结果,二者对酵母样真菌的鉴定效能无显著差异（McNemar检验,P＞0.05）.结论 两种商品化产品对酵母样真菌的鉴定效能基本一致;相较而言,RapID YST在操作便捷性、检测时间方面具有较大优势.     

酵母双杂交相关方法的改良及应用

对酵母双杂交实验过程中较为耗时的阳性克隆鉴定过程进行改进,以期建立一种快速有效的鉴定方法。分别采用液氮冻融法、超声破碎法、渗透压破壁法以及煮沸裂解法裂解酵母细胞,获得质粒作为PCR模板,直接测序鉴定筛选到的相互作用蛋白。以液氮冻融法和超声破碎法裂解细胞获得的质粒为模板进行PCR,得到特异的产物,测序鉴定结果明确,与经典的鉴定方法相比效果相当,但更加经济快捷;而渗透压破壁法和煮沸裂解法则效果不好。说明前两种方法可代替常规方法用于阳性克隆的鉴定,从而加快酵母双杂交实验中大量阳性克隆的筛查工作。     

耐低温酵母Curvibasidium rogersii菌株在松萝样品中的首次分离鉴定及基于基因组分析的生物特性探究

【目的】对西藏松萝地衣来源的两株非常规酵母进行分离鉴定,并通过基因组序列分析探究其生物学特性和应用潜力。【方法】从西藏来源的松萝地衣样品内部分离得到2株耐低温酵母菌株,通过26S D1/D2和ITS序列比对分析以及生理生化实验进行菌种鉴定;通过全基因组序列分析和验证探究菌株的生物特性。【结果】两株酵母菌株经鉴定均为Curvibasidium rogersii,可以在10℃低温良好生长,在20℃生长最佳,25℃及以上温度生长缓慢或不生长。对其进行基因组测序和基因组挖掘,测序结果发现,其基因组注释出功能的部分与产油脂的低温酵母白冬孢酵母Leucosporidium creatinivorum具有最高相似性,尼罗红染色发现两株酵母都能够生产油脂,另外在基因组序列中还发现了可能参与木糖代谢的相关蛋白编码基因,实验证明两个酵母菌株可以利用木糖生长。【结论】首次分离鉴定了来自西藏松萝的酵母C. rogersii,为充分开发利用松萝和其他地衣来源微生物,以及利用可代谢木糖的新资源酵母生产微生物油脂提供了基础。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。     

小鼠IL-35基因毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的构建真核酵母表达载体pPIC9K与小鼠IL-35基因的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,在毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,并对其进行鉴定。方法以pET-30a-mIL-35为模板,用PCR扩增出IL-35去信号肽基因全序列,并在3'端引入His标签,构建重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,经SalⅠ线性化重组质粒后,用电穿孔方法将该基因转染毕赤酵母细胞内。经G418梯度筛选高拷贝转化子,筛选Mut+表型后经PCR进一步鉴定IL-35基因与酵母染色体是否整合。小量诱导表达筛选出高表达菌株,大量甲醇诱导表达,以SDS-PAGE及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。结果小鼠IL-35基因真核酵母表达载体pPIC9K-mIL-35-His构建成功,并且在GS115中通过甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析,可见相对分子质量约为65 000的目的蛋白。结论实验所构建的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His可在毕赤酵母GS115中正确的表达小鼠IL-35基因。     

低乙醇酵母的分离和培养

酵母是食用酵素的主要发酵菌种之一。由于酵母在厌氧状态下产生的乙醇会对乳酸菌等其他酵素发酵菌种形成抑制,因此,有必要在发酵状况良好的自然发酵酵素中分离低乙醇产生的酵母。经过三级筛选,获得了两株糖转化能力强、pH和酒精反馈抑制弱的酵母,经18S rDNA鉴定为毕赤酵母(Pichia sorbitophila)和接合酵母(Zygosaccharomyces parabailii)。用筛选出的酵母发酵果蔬汁,与自然发酵的果蔬汁相比,酵母发酵液具有酒精含量低、糖转化迅速等特点,并对沙门氏菌等四种致病菌产生明显的抑制。     

尼罗红染色法筛选产油酵母及定量检测胞内油脂含量的研究

【目的】建立产油酵母筛选以及胞内油脂含量测定的简便方法。【方法】利用尼罗红与胞内油脂成分结合后在紫外光照射下发出荧光且荧光强弱与油脂含量相关的原理。通过在添加尼罗红的培养基中培养酵母,并观察菌落荧光的方法对385株深海酵母进行产油脂菌株筛选,利用26S rDNA D1/D2区序列分析方法对筛选获得的产油酵母菌株进行鉴定,并以其中的一株高产油脂酵母(2A00015)为试验菌株,建立了一套尼罗红染色快速测定油脂含量的方法。【结果】获得22株产油酵母,其中油脂含量最高可达62.9%,经分子鉴定后显示这22株酵母分别属于(Candida viswanathii)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)以及Rhodosporidium paludigenum酵母。尼罗红染色快速测定油脂含量方法的最佳检测条件为:菌悬液OD600小于1.2,尼罗红浓度0.5 mg/L,染色时间5 min,激发波长488 nm,发射波长570 nm。该测定方法得到相对荧光强度与称重法得到油脂含量呈正相关性,R2=0.9637。     

一株产虾青素酵母菌株的鉴定

从市售海水鱼内脏中分离得到一株产虾青素的酵母,编号为NZ- 01.采用传统形态学鉴定方法及rDNA序列分析法分别对从NZ- 01进行鉴定.形态学鉴定结果表明该菌为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),分别用特异性引物对rDNA 序列的18S rDNA D1/D2区、26S rDNA D1/D2区和ITS区进行扩增,PCR产物测序,将测序结果登录GenBank进行BLAST分析,结果均与形态学观察结果一致,NZ- 01为胶红酵母.     

aiiA基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

构建携带N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)的重组毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-aiiA,采用电转化方法转入毕赤酵母GS115,经营养缺陷型培养基、表型鉴定和高G418浓度筛选获得高拷贝表达盒的酵母转化子,用0.5%甲醇诱导表达,RT-PCR鉴定可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,aiiA基因在毕赤酵母中成功表达,用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有降解N-酰基高丝氨酸内酯的活性。     

酵母双杂交系统的发展及其衍生系统的比较

酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。本文系统介绍了该技术的背景、发展过程,以及由Fields和Song初次描述的由酵母双杂交系统衍生而来的几种主要的双杂交系统的特点,并简要比较了各系统的优缺点。     

IGS基因及RAPD标记分析在加特隐球酵母基因分类中的应用

根据ITS1-5.8S-ITS2区域的特异核酸序列变化,加特隐球酵母Cryptococcus gattii(≡新型隐球酵母加特变种Cryptococcu neoformans var.gattii)可分为6种基因型。本研究通过检测加特隐球酵母的IGS基因,发现其IGS序列有着更丰富的变异和信息位点。通过结合加特隐球酵母RAPD(随机扩增的多态性DNA)图谱比较研究,与IGS和ITS的序列分析结果大体一致,说明新近发现的加特隐球酵母ITS8型确实有别于以前报道过的其他加特隐球酵母ITS基因型。研究证明IGS1及IGS2基因片段分析可以作为加特隐球酵母基因分类鉴定中有效的辅助鉴别的分子生物学方法,联合多种基因分类鉴定的方法可以更有效地揭示新型隐球酵母加特变种种内不同基因亚型间的遗传进化关系。     

TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

构建TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白的酵母表达体系。利用PCR技术,从重组质粒pET28a-TMPFc中,扩增TPO模拟肽与人IgG1Fc 的DNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,电激法转化毕赤酵母。用MDH和MMH筛选具有正确表型的重组转化子,PCR、蛋白质印迹鉴定融合基因。MTT法鉴定TMPFc对Ba/F3mpl细胞生长的促进作用。构建的重组毕赤酵母实现了TMPFc的分泌表达,表达量占外分泌蛋白质的65%。表达蛋白质的相对分子量约64kD,对Ba/F3mpl生长具有促进作用。TMPFc酵母表达体系表达出可观的二价模拟肽,为二价TMP活性的定量研究奠定基础。     

鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为构建鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体,以本实验室分离鉴定的DuCV GH01株Cap基因为模板,对其进行酵母密码子优化后,连接到pGBKT7载体上构建诱饵质粒,经菌落PCR、酶切鉴定以及测序后,转化酵母菌株Y2HGold感受态,检测诱饵蛋白表达以及诱饵蛋白对酵母细胞毒性和自激活现象。结果表明,优化后的Cap基因全长774bp,成功连接到诱饵载体pGBKT7中,重组质粒pGBKT7-Cap转入酵母细胞后,Western blot检测到50kD左右的蛋白条带,诱饵蛋白对酵母细胞既无毒性,又没有自激活现象。为进一步利用酵母双杂交技术筛选与Cap蛋白互作的蛋白奠定了基础。     

牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达

目的:实现重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达。方法:依据毕赤酵母的密码子偏爱性设计并利用PCR方法合成了牛促卵泡激素的α亚基和带有6×his-tag的β亚基相应的DNA序列,构建表达载体pHIL-S-bFSH,转化毕赤酵母,表达蛋白进行ELISA定量和Western blot鉴定。结果:重组牛促卵泡激素的表达量为0.26mg/L,Western blot鉴定分子量为35kDa。结论:在毕赤酵母中实现了具有免疫源活性的重组牛促卵泡激素的表达。