耐甲氧苯青霉素葡萄球菌mecA基因的检测

耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）和表皮葡萄球菌（ＭＲＳＥ）引起的医院感染已成为当今世界范围内的严重问题。青霉素结合蛋白２ａ（ＰＢＰ２ａ）是引起葡萄球菌耐甲氧苯青霉素的主要原因,它是由耐药基因ｍｅｃＡ编码的。本文主要综述近年来国外关于ｍｅｃＡ基因检测方法的研究进展,尤其是多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用。     

β—内酰胺抗生素与葡萄球菌青霉素结合蛋白的相互作用

β－内酰胺抗生素攻击的目标是细菌中的青霉素结合蛋白（ＰＢＰ）。葡萄球菌中有４种ＰＢＰ（ＰＢＰ１～４）,只要有１种存在即能合成细胞壁。葡萄球菌的耐药机理有多种：由于β－内酰胺酶的产生,ＰＢＰ的改变,对耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）则由于另一种ＰＢＰ２ａ的产生。ＰＢＰ２ａ有合成细胞壁的功能,但对β－内酰胺抗生素亲和力低。此ＰＢＰ由ｍｅｃＡ基因编码,有认为这是一个外基因与自身β－内酰胺酶基因重     

大鼠酰胺化酶的信号肽引导的昆虫细胞表达外泌系统

将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）、ＰＡＢＣＩＧＦＩ融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒ｐＢａｃＰＡＧ２、ｐＢａｃＰＡＩ,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒ＢａｃＰＡＧ、ＢａｃＰＡＩ。将重组病毒感染Ｓｆ２１细胞,ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）和ＰＡＢＣＩＧＦＩ均得到有效外泌表达,表达产物通过ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ柱可获得快速纯化。     

大鼠甘氨肽α—羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达

将编码大鼠甘氨肽α－羟化单氧酶（ＰＨＭ）ｃＤＮＡ基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体ｐＢａｃＰＡＫ８,构建成表达质粒ｐＢａｃＰＨＭ２,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的ＰＨＭ基因的重组病毒ＢａｃＰＨＭ。用ＢａｃＰＨＭ感染Ｓｆ２１细胞,无血清培养上清在７２小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫     

蚕豆叶片下表皮ABA结合蛋白提取及分离条件的选择

以蚕豆（ＶｉｃｉａｆａｂａＬ．）叶片下表皮为材料,比较ＴｒｉｔｏｎＸ１００、冷丙酮和（ＮＨ４）２ＳＯ４对ＡＢＡ结合蛋白（简称ＡＢＡＢＰ）的提取效果。结果表明：０．５％（Ｗ／Ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ１００去垢剂提取的ＡＢＡＢＰ与ＡＢＡ特异结合活性较高（０．４８７ｎｍｏｌ／ｇｐｒｏｔｅｉｎ）,维持结合活性的时间较长（４℃下反应４０ｈ保持最大结合的６０％）;而冷丙酮法提取的ＡＢＡＢＰ特异结合活性只有０．３２５ｎｍｏｌ／ｇｐｒｏｔｅｉｎ,且容易失活,１０ｈ仅保持最大结合的３０％左右。实验比较了各种盐离子对ＡＢＡＢＰ的影响,高盐（＞３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）不利于ＡＢＡＢＰ的结合反应,低浓度ＫＣｌ对ＡＢＡＢＰ活性略有促进。ＡＢＡＢＰ的结合活性需要介质中有一定量的Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋,用ＥＤＴＡ螯合介质中Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋后,ＡＢＡＢＰ活性大大降低,分别为最大结合的７５％和６０％。ＡＢＡＢＰ与ＡＢＡ反应的最适ｐＨ在６．５,这些条件为亲和层析纯化ＡＢＡＢＰ提供了依据。     

重组家蚕病毒表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

将传染性囊病病毒ＨＺ９６株主要宿主保护性抗原ＶＰ２的ｃＤＮＡ基因克隆到杆状病毒转移载体ｐＢａｃ－ＰＡＫ８中,获得重组转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２,载体ｐＢａｃＰＡＫ－ＶＰ２与修饰病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ６线性化基因组ＤＮＡ共转染单层家蚕Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（Ｂｍ）Ｎ细胞,经细胞内同源重组,筛选到重组病毒。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫鲩迹结果表明,ＶＰ２在家蚕培养细胞和家蚕幼虫中均得到了表达。     

血管紧张素Ⅱ对大鼠心肌肌浆网Ca~(2+),Mg~(2+)-ATPase基因转录调节的影响

观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）对心肌肌浆网Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰａｓｅ基因（ＳＥＲＣＡ２ａ）转录调节的影响,评价ＤＭＰ８１１对此效应的干预作用．６周龄雄性ＳＤ大鼠随机分为３组,每组６只．组１：生理盐水输注;组２：ＡｎｇⅡ输注＋ＤＭＰ８１１管饲（３ｍｇ·ｄ－１·ｋｇ－１）;组３：ＡｎｇⅡ输注（２００ｎｇ·ｍｉｎ－１·ｋｇ－１．１周后称其体重,取心脏并称重,提取心脏总ＲＮＡ后采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ的方法检测ＳＥＲ－ＣＡ２ａ的转录水平,采用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡｎｇⅡ１型受体（ＡＴ１）ｍＲＮＡ水平．实验后,组３心重（ＣＷ）、心重／体重（Ｃ／Ｂ）、ＡＴ１受体转录水平均高于组１（分别增加４．７±０．４％,４．９±０．９％和２４．７±３．５％;Ｐ＜０．０１）,而ＳＥＲＣＡ２ａ基因转录水平显著低于组１（降低２０．１±３．０％,Ｐ＜０．０１）,并且ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平与ＡＴ１受体ｍＲＮＡ水平呈负相关（ｒ＝－０．７４,Ｐ＜０．０１）．ＡｎｇⅡ导致的上述改变能被ＤＭＰ８１１完全阻断．ＡｎｇⅡ通过其Ⅰ型受体的介导,诱导了ＳＥＲＣＡ２ａ的转录下调     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2I的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶 Ａ２ Ｉ（ Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ） 的基因克隆至表达载体ｐ Ｂ Ｌ Ｍ Ｖ Ｌ２ , 在大肠杆菌 Ｒ Ｒ１ 中成功表达。表达产物 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ约占细菌蛋白质总量的３０ ％ , 以包含体的形式存在。纯化包含体后, 将产物变性、复性, 然后用 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｔ Ｍ１２ 纯化, 产物经过 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 检测只有单一条带。对表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定。结果显示, 表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ的酶活性同变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶 Ａ２（ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２） 的酶活性相近, 既具有抑制血小板聚集活性也具有溶血活性。最后对磷脂酶 Ａ２（ Ｐ Ｌ Ａ２） 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

PAF对肺内小动脉平滑肌细胞TXA_2，PGI_2乃Ca~（2＋）－ATPase的影响

本工作采用分离培养家兔肺内小动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣｓ），观察了外源性血小板活化因子（ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＰＡＦ）、ＢＮ５２０２１（ＰＡＦ受体拮抗剂）、吲哚美辛、维拉帕米对ＰＡＳＭＣｓ产生血栓素Ａ_２（ＴｘＡ_２）、前列环素（ＰＧＩ_２）及对细胞膜Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力的影响。结果表明：（１）基础状态下ＰＡＳＭＣｓ存在花生四烯酸（ＡＡ）代谢。（２）外源性ＰＡＦ通过受体后途径激活环加氧酶促进ＡＡ代谢致ＴＸＡ_２及ＰＧＩ－２增加，ＴＸＡ_２／ＰＧＩ_２比值无明显变化。（３）外源性ＰＡＦ能直接抑制Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力。（４）维拉帕米可逆转ＰＡＦ抑制ＰＡＳＭＣｓ膜Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力的效应。     

用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HBVe抗原

通过基因工程操作,使乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）基因与绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ）融合,用新型Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ＨＢｅＡｇ－ＧＦＰ双功能融合蛋白。经ＥＬＩＳＡ法和荧光显微镜观察证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＢＶ的ｅ抗原活性,为免疫诊断新方法的建立进行了有益的探索。     

用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HBVe抗原

通过基因工程操作,使乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）基因与绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ）融合,用新型Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ＨＢｅＡｇ－ＧＦＰ双功能融合蛋白。经ＥＬＩＳＡ法和荧光显微镜观察证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＢＶ的ｅ抗原活性,为免疫诊断新方法的建立进行了有益的探索     

重组人骨形态形成蛋白2在家蚕幼虫中表达及产物纯化

将编码人ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因插入昆虫杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ１,与修饰的家蚕核形多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞,通过同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的ＢＭＰ２ｃＤＮＡ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ－ＢＭＰ２。用重组病毒感染家蚕幼虫,第五天ＢＭＰ２表达率最高,每毫升蚕血淋巴中约１０μｇ表达产物;表达产物在在体内被加工成Ｃ－端１６ｋＤ片段,以二硫键连结成分子量为３０ｋＤ的同源二聚体;经纯化获得９０％以上纯度的成熟ＢＭＰ２,与骨基质胶原结合后植入大鼠皮下,７天后在局部诱导生成软骨组织。     

糖皮质激素抑制加压素释放的细胞膜机制

利用离休孵育脑薄片和放射免疫测定其释放的精氨酸加压素（ＡＶＰ）方法,探讨糖皮质激素（ＧＣ）在不能进入细胞内的情况下,对去肾上腺大鼠的下丘脑薄片释放ＡＶＰ的快速影响及其可能的细胞膜机制。结果如下：（１）下丘脑薄片能够稳定地释放ＡＶＰ（２ｈ）,其释放量为１５．４２±１．２８ｐｇ／ｍｉｎ;（２）牛血清白蛋白耦联皮质酮（Ｂ－ＢＳＡ）对ＡＶＰ的释放具有快速的（２０ｍｉｎ）抑制性效应,在１０￣（－７）─１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ范围内呈剂量一效应关系;（３）ＧＣ细胞内受体拮抗剂ＲＵ４８６（１０￣（－４）─１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ）能部分地阻断Ｂ─ＢＳＡ的快速抑制效应;（４）孵育液中Ｃａ￣（２＋）程度升高,Ｂ─ＢＳＡ的快速抑制效应明显增强;反之,孵育液中无Ｃａ￣（２＋）则Ｂ－ＢＳＡ的快速抑制效应有所减弱。表明ＧＣ在未进入细胞内的情况下也可快速地抑制大鼠下丘脑薄片释放ＡＶＰ,因此没有通过传统的基因组机制,而是由非基因组机制介导的,其作用部位在细胞膜水平上,可能是影响Ｃａ￣（２＋）的跨细胞膜内流通量或／和影响有Ｃａ￣（２＋）参与的ＡＶＰ释放过程的结果。     

兔阑尾中一种新的21kD的钙结合蛋白的纯化与鉴定

纯化与鉴定了Ｂ淋巴细胞中一种新的分子量为２１ｋＤ的钙结合蛋白（ＣａＢＰ２１）。兔阑尾淋巴细胞匀浆经热变性,Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ与ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析,自每１ｋｇ细胞沉积物中获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ均一的ＣａＢＰ２１５．３ｍｇ。ＨＣｌ水解后的酸性氨基酸（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）含量为２６％。如同大多数钙结合蛋白一样,Ｎ末端封闭阻止其进行Ｅｄｍａｎ降解。ＣａＢＰ２１中疏水性氨基酸（计Ｇｌｙ,不计Ｔｒｐ）约占４６％,碱性氨基酸１０％,酸性氨基酸与极性氨基酸约４４％。ＣａＢＰ２１有较高的Ｓｅｒ、Ｔｙｒ含量。肽谱分析等确证ＣａＢＰ２１为２个相同或相似亚基二聚体。以ＡｒｓｅｎａｚｏⅢ作Ｃａ２＋结合分析表明每分子ＣａＢＰ２１可结合４分子Ｃａ２＋,对Ｃａ２＋的结合常数约为１０－５ｍｏｌ／Ｌ。各种性质表明ＣａＢＰ２１是一种不同于其他已知钙结合蛋白的新钙结合蛋白。     

GABA和孕酮对人及豚鼠精子的体外获能作用

为了探讨γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）是否参与人及豚鼠精子体外获能的调节,将生育男子和豚鼠清子分别悬浮于ＢＷＷ和低Ｃａ＾２＋最小获能培养基（ＬＣａ＾２＋－ＭＣＭ）中,加入ＧＡＢＡ、孕酮（Ｐ４）、ＧＡＢＡＡ受体激动剂及其拮抗剂,在５％ＣＯ２孵箱３８．５℃培养２ｈ。然后用ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ Ａ２３１８７激发精子顶体反应（ＡＲ）和超激活运动（ＨＡＭ）。以精子与金霉素（ＣＴＣ）荧光结合类型、ＡＲ和ＨＡＭ为指标来     

牛血清白蛋白耦联皮质酮可以抑制精氨酸加压素的释放

本实验利用高体孵育脑薄片和放射免疫测定精氨酸加压素（ＡＶＰ）的方法,初步探讨了牛血清白蛋白耦联皮质酮（Ｂ－ＢＳＡ,不易进入细胞内）对大鼠下丘脑薄片（含室旁核和视上核）释放ＡＶＰ的影响和可能机制。结果：（１）Ｂ－ＢＳＡ（１０－７─１０－４ｍｏｌ／Ｌ）在２０ｍｉｎ内对大鼠下丘脑薄片ＡＶＰ的释放具有明显的抑制性效应,且呈剂量一效应关系;（２）ＲＵ４８６（１０－４─１０－３ｍｏｌ／Ｌ）能部分地阻断Ｂ－ＢＳＡ的抑制效应;（３）Ｂ－ＢＳＡ的抑制效应随孵育液中Ｃａ２＋浓度的升高而明显增强;（４）在有新毒素（１０－３─１０－２ｍｏｌ／Ｌ）存在的情况下,Ｂ－ＢＳＡ的抑制效应显著增强。上述结果表明糖皮质激素在未进入细胞内的情况下亦可抑制大鼠下丘脑薄片释放ＡＶＰ。此作用发生在细胞膜水平上,由非基因组机制所介导,可能是影响Ｃａ２＋跨细胞膜流动的结果。     

多重PCR法检测对皮下和造血器官坏死杆状病毒

根据对虾皮下和造血坏死杆状病毒（ＨＨＮＢＶ）ＨＨＮＢＶ－ＸＩＡ靶基因序列设计了４个多重ＰＣＲ法用引物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４）。采用了五种引物组合形式分别对ＨＨＮＢＶ－ＸＩＡ、ＨＨＮＢＶ基因和ＰＲＤＶ－ＪＡＰＡＮ片段进行了物异扩增,建立了多重ＰＣＲ检测ＨＨＮＢＶ方法。通过优化多重ＰＣＲ法检测ＨＨＮＢＶ条件,可从阳性感染的中国对虾ｆｇ级ＤＮＡ中定性检测出皮下和造血器官坏死杆状病毒。     

江浙蝮蛇磷脂酶A2基因的多样性研究

我们利用简并引物从江浙蝮蛇腺总ＲＮＡ经ＲＰ－ＰＣＲ扩增磷脂酶Ａ２（简称ＰＬＡ２）基因,并以碱性ＰＬＡ２（Ｂ－ＰＬＡ２）基因为探针,分离出了酸性ＰＬＡ２（Ａ－ＰＬＡ２）和两个未见报道的特征结构类同的基因,分别命名为Ａｓｎ＾４８－ＰＡＬ２和ＢＡ－ＰＡＬ２。双向测序测定了这组ＰＬＡ２同工酶（除信号肽外）基因的全序列,并由此推导编码的氨基酸序列。其中Ａ－ＰＬＡ２基因编码的氨基酸序列与较早报道的由蛇毒中分离     

前列腺素对肺泡巨噬细胞分泌白细胞介素—8的调控

本实验在经血清调理酵母聚糖激活的大鼠肺泡巨噬细胞（ＡＭ）体外培养４ｈ后,检测其上清液中的ＰＧｓ含量。消炎痛预处理使激活的ＡＭ释放的ＰＧＥ１、Ｅ２、Ｆ２ａ量显著减少,Ｅ２／Ｅ１和Ｅ２／Ｆ２ａ比值降低;而细胞松弛素Ｂ预处理ＡＭ则可使上述ＰＧｓ的含量增加。以中性粒细胞趋化指数来反映ＩＬ－８的活性,表明消炎痛预处理ＡＭ组的ＩＬ－８的分泌量显著减少,而细胞松弛素Ｂ预处理ＡＭ组的ＩＬ－８分泌量显著增多。ＡＭ的     

两类Ca~(2 )通道拮抗剂对脑缺血时Ca~(2 )/CaM PK Ⅱ活性抑制的保护作用

本文以蒙古沙土鼠双颈总动脉结扎（ＢＣＡＯ）前脑缺血模型Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性变化为指标,研究了以氯胺酮（ＫＴ）、右美沙芬（ＤＭ）、苄丙咯（ＢＰ）及硝苯吡啶（ＮＤ）为代表的配体门控Ｃａ２＋通道（ＬＧＣＣ）及电压门控Ｃａ２＋通道（ＶＧＣＣ）两类Ｃａ２＋通道拮抗剂对缺血性脑损伤的保护作用。结果如下：（１）脑缺血后,胞浆型及颗粒型Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性均明显下降;（２）缺血前单独用药,ＫＴ、ＤＭ、ＢＰ及ＮＤ对酶活性均具有剂量依赖性的保护作用;（３）与单独用药相比,联用异类药,ＫＴ＋ＢＰ、ＫＴ＋ＮＤ及ＤＭ＋ＢＰ的保护作用显著增高,而联用同类药,ＢＰ＋ＮＤ及ＫＴ＋ＤＭ的保护作用无明显增高。结果提示：脑缺血中,ＬＧＣＣ及ＶＧＣＣ两类Ｃａ２＋通道均参与了缺血性脑损伤过程;两类Ｃａ２＋通道的单一拮抗对缺血性脑损伤均有保护作用,而联合拮抗效果更佳。