产乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因工程菌的构建及遗传稳定性研究

利用质粒pET22b( )为表达载体,成功构建了产N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因工程菌BL21 - pET22b( )-argE,并考察了重组质粒的稳定性.双酶切鉴定了质粒构建正确,SDS-PA GE电泳证实了该菌可高效表达目的蛋白.连续传代50次实验表明重组质粒具有结构稳定性.无选择压力连续传代时,质粒丢失严重;有选择压力时连续传代未发生质粒丢失现象,具有较好的分离稳定性.发酵过程中,用羧苄青霉素代替氨苄青霉素,质粒稳定率由77.78%提高到8 6.42%.羧苄青霉素浓度为200μg/mL时,质粒稳定率提高到98.33%.     

细菌质粒的稳定性

引言 质粒稳定性在微生物遗传工程研究和生产中占有十分重要的地位,只有构建高表达同时高稳定的重组质粒才能达到高产的目的。 一般的说,在没有选择压力时培养含质粒细胞若干代,出现无质粒细胞即是质粒不稳定。     

鸡γ-干扰素基因重组质粒在工程菌株中的稳定性研究

本文通过传代的方法研究了鸡γ-干扰素基因的重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌CH1中的遗传稳定性.结果表明重纽质粒在没有筛选压力下存在质粒不稳定性,100代时质粒稳定性只有69%.适当的筛选压力可以显著降低质粒的遗传不稳定性,100代时稳定性提高到95%.各代重组菌株在生长性能、质粒酶切图谱、蛋白表达等方面均保持一致,未见明显差异.生物活性检测原代和100代均达到1.0×105 IU/mL以上.以上结果表明重组质粒pET-ChIFN-γ在工程菌株CH1中具有良好的遗传稳定性,其质粒遗传不稳定性可由适当的筛选压力来控制.     

诺卡氏菌腈水合酶基因在重组毕赤酵母中的表达

为从基因水平上改造腈水合酶,进行了诺卡氏菌腈水合酶基因的外源表达研究。在重组大肠杆菌表达系统内,腈水合酶的α亚基几乎不能正常表达,在重组E. coli BL21(DE3) (pET32aNHBAX)中,腈水合酶活性仅为0.04U/mg。构建重组毕赤酵母表达质粒pPIC3.5kNHBAX,采用电穿孔转化法将其转入宿主菌P. pastoris GS115中,经过菌株培养和腈水合酶的诱导表达,筛选获得了优选菌株P. pastoris NH4。对P. pastoris NH4的细胞培养和腈水合酶的诱导表达条件进行优化,结果表明,重组腈水合酶在毕赤酵母中的表达水平可以达到0.52U/mg,但不能稳定积累。     

腈水合酶NHaseK在大肠杆菌中的功能表达

腈水合酶由α亚基和β亚基组成,活化元件对其功能表达至关重要,研究腈水合酶基因簇中各元件的表达比例对酶重组表达的影响具有重要意义。以来源于Klebsiella oxytoca KCTC 1686的腈水合酶（NHaseK）为研究对象,构建了多种表达策略,以期实现α亚基、β亚基和活化元件17k差异表达。利用pETDuet-1质粒具有双T7启动子的特点,将上述基因以八种不同的组合方式分别插入于两个启动子之后。当将三段基因同时插入于第一个启动子之后时,亚基表达量均衡,比活力为0.78 U/mg蛋白,是亚基表达量比例为5：3时的124%。在此基础上,在第二个启动子之后插入活化元件基因,活化元件表达水平提升2倍,比活提升5%,为0.82 U/mg蛋白。当将α亚基和β亚基插入于不同启动子之后时,酶活仅为对照组的10%,说明NHaseK的亚基必须同时转录才可形成成熟蛋白。进一步考察质粒拷贝数对大肠杆菌表达NHaseK的影响,确定15~20的质粒拷贝数足够实现NHaseK的功能表达。结果表明,亚基的均衡表达以及活化元件的充分表达对NHaseK的重组表达具有积极作用。     

转TNF-α基因鱼腥藻7120质粒稳定性研究

为了实现转基因鱼腥藻培养生产TMF的目的,讲究了转基因鱼腥藻的稳定性。影印法证实转TNF-α。基因鱼腥藻7120能保持质粒分配稳定性。比较无选择压力下连续传代的转丛因鱼醒藻7120在不同培养基中的生长和外源基因表达,证实没有发生质粒部分缺失,但转基因鱼腥藻在无选择压力下会降低重组质粒拷贝数。在培养过程中,种子培养越含有的新霉素可以保持生产过程质粒稳定,这可以大火减少新霉素用量。     

含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究

为了分析研究含抑制素重组质粒pVAX-IS-asd(以下简写为pXAIS)的crp(cAMP受体蛋白)和asd(天冬氨酸β-半乳搪脱氢酶)基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株的遗传稳定性.方法:将现有的无抗性抑制素重组表达质粒pXAIS转化入crp和asd基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株(简称"空质粒株")中,得"含质粒株".将"含质粒株"细菌在无选择压力条件下传代培养50代.利用酶切鉴定方法,分析"含质粒株"细菌中抑制素pXA/S质粒的稳定性;利用PCR方法扩增菌株("含质粒株"和"空质粒株")保守序列中invA基因,分析各代细菌的invA基因稳定性;通过比较传代培养后各代细菌的生长图型,分析"含质粒株"细菌传代后的生长规律.结果表明,"含质粒株"细菌连续传代50次后,仍能检出pXAIS质粒和invA基因,而且生长规律与"空质粒株"没有明显差异.说明含pXAIS质粒的猪霍乱沙门氏菌crp和asd基因双缺失株具有良好的遗传稳定性.     

重组别藻蓝蛋白β亚基（His-β~（APC））表达菌株遗传稳定性的研究

工程菌株的遗传稳定性在目的产物的生产应用中至关重要。为了确定工程菌株的遗传稳定性,通过对重组别藻蓝蛋白β亚基（His-βAPC）生产菌株E.coliJM109（DE23）/pET28α-βAPC进行了菌体生长量的测定,平板划线,质粒酶切,产物鉴定等研究,检验了该工程菌质粒的稳定性。通过实验得到如下结果：该工程菌株在没有抗生素选择压力下传代,质粒丢失率为5代6%,10代8%,15代9%,20代15%;该菌株经固体平板连续划线传代20次后,菌落大小和形态基本不变;质粒经BamHⅠ和HindⅢ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳结果显示该菌株携带的重组质粒目的片段在传代前后没有发生变化;经诱导培养后,His-βAPC在原代和第5、10、15和20代宿主菌中都可以表达,表达量没有明显差别,且表达产物在SDS-PAGE中的带型基本一致。以上结果表明,该工程菌质粒具有结构稳定性和分裂不稳定性。     

重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性

目的通过菌株传代方法观察携带致死因子(lf)基因的重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21的传代稳定性。方法将重组菌株pET-28(a)/LF/BL21在含有卡那霉素的LB培养基中连续传代至100代,比较第1、10、20、50、100代菌株的菌落形态、细菌形态、生化特性、质粒保有率、生长速度等的差异;取各代次菌株提取质粒DNA且分别进行双酶切及PCR鉴定、DNA测序;诱导表达各代次菌株,比较各代次菌株的重组rLF蛋白的表达水平及免疫反应性。结果各代次菌株菌落形态、生化特性、生长速度等方面与原始种子库无明显差异;在传至100代时的质粒保有率为76%;各代次菌株重组质粒电泳图谱、酶切图谱、PCR图谱未改变,未见lf基因变异;各代次菌株的总蛋白电泳图谱r、LF蛋白表达量r、LF蛋白的免疫反应性与原始种子库无明显差异。结论重组大肠杆菌pET-28(a)/LF/BL21具有较好的传代稳定性。     

单点突变葡萄糖异构酶(GIG138P)基因在变铅青链霉菌中的高效表达及其稳定性研究

通过三步亚克隆 ,将单点突变葡萄糖异构酶 ( GIG1 38P)基因及其调控序列插入链霉菌质粒p IJ40 83,构建重组表达质粒 p IJ40 83- GI1 .用重组质粒转化变铅青链霉菌 TK54原生质体 ,经硫链丝菌素抗性 ( Th R)筛选 ,获得重组菌株 TK54/p IJ40 83- GI1 .酶活力测定和 SDS- PAGE分析表明 ,GIG1 38P基因在变铅青链霉菌中得到高效表达 ,GI1粗酶液比活力为 1 5U/mg,GI1表达量约占菌体可溶性蛋白的 2 5% .同时也研究了重组质粒的遗传稳定性 .重组菌株在无选择压力条件下经液体连续传代培养 ,GI1比活力和 GI1表达量在 2 0 0 h传代时间中呈平缓下降趋势     

重组人内皮抑素工程菌菌种稳定性考察

研究重组人内皮抑素突变体质粒HM-E的宿主菌E．coliBL21（DE3）在LB培养基中传代50代过程中菌种的稳定性。研究表明,重组人内皮抑素工程菌在传代50代的过程中质粒稳定性（ST）高,为98％,菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态,反复冻融后表达量未下降,目标蛋白在菌体超声的沉淀中质量分数为（58．75±3．78）％,同时,四甲基偶氮唑盐微量反应比色法（MTT）结果表明目的蛋白质量浓度为20μg／mL时对内皮细胞ECV-304具有很高的抑制率,达（94．72±2．10）％。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

IL-1023-57-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。     

A new method for protein coexpression in Escherichia coli using two incompatible plasmids

It is commonly believed that incompatible plasmids carrying the same replicon cannot coexist stably in one Escherichia coli cell. However, we found that two incompatible plasmids carrying different antibiotic resistance genes, if under the selection pressure of the two antibiotics, can coexist in E. coli for at least 14 h, which is adequate for routine culture and protein expression. Based on this discovery, we developed a new method to coexpress foreign proteins in E. coli using two incompatible plasmids. The coding regions of the two subunits (DFF45 and DFF40) of the human DNA fragmentation factor (DFF) were cloned into two incompatible bacterial expression vectors-pET-21a with ampicillin resistance and pET-28a with kanamycin resistance, respectively. The two resulting plasmids were used to cotransform E. coli BL21(DE3) cells. After selection by ampicillin and kanamycin simultaneously, cotransformants that contain both recombinant plasmids were obtained. Induced by isopropyl beta-d-thiogalactoside, DFF45, and DFF40 were coexpressed efficiently in the presence of the two antibiotics. The coexpression product contained adequate soluble portions for both DFF45 and DFF40, while all DFF40 was insoluble if expressed alone. The coexpression product also exhibited the same caspase-activated DNase activity as its natural counterparts, which cannot be obtained if its two subunits are expressed separately.     

凋亡素融合蛋白的可溶性表达及活性分析

目的:构建PET-28a-SPA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现其高效可溶性表达,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。方法:本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-28a-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western blot检测,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白20%左右。上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合,并且对A549肺癌细胞及Hela细胞具有一定的凋亡作用。结论:所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变

目的:构建ADAMI0真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础.方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1 ～910bp和911 ～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DB)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定.结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变.结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒.     

A组人轮状病毒NSP3基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得轮状病毒NSP3基因的表达产物及其抗血清。方法:将TB-Chen株轮状病毒NSP3基因插入质粒pETL,构建重组表达质粒pET-NSP3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白NSP3;用凝胶分离回收的方法纯化该蛋白,免疫豚鼠制备该蛋白的抗血清。结果:构建了重组表达质粒pET-NSP3,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白NSP3,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的28.6%;有效地纯化了目的蛋白并制备了该蛋白的抗血清,Western印迹表明该抗血清能与重组蛋白NSP3发生特异性免疫反应。结论:通过质粒pETL能高效表达轮状病毒NSP3蛋白,该重组蛋白具有较好的免疫反应性,为进一步研究其结构、功能及免疫学性质奠定了基础。