小分子伴侣协助重组人γ-干扰素体外复性研究

考察了小分子伴侣在游离和固定化两种情况下,对重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）体外重折叠复性的作用.实验结果表明,小分子伴侣GroEL191～345的加入有效地促进了rhIFN-γ的复性,在初始蛋白质浓度为100 mg/L时,rhIFN-γ复性后蛋白质回收率提高了2.2倍,总活性提高了近3倍;将小分子伴侣固定化在NHS-activated Sepharose Fast Flow凝胶后,不但能重复利用,而且进一步提高了rhIFN-γ复性效率,在初始蛋白质浓度为400 mg/L 时,仍使蛋白质回收率达到46.29%和比活达到1.95×10⁷ U/mg.     

鲤鱼,鲫鱼和鲤鲫移核鱼DNA的复性动力学研究与比较

才文报道鲤鱼、鲫鱼DNA复性动力学研究结果。它们均由快、中、慢速复性3个组份构成。鲤鱼DNA中Cot<1×10(-1)的复性组份占7.5％,1×10(-1)1×10~2的复性组份占75％;鲫鱼DNA中Cot<5×10~(-1)的复性组份占22％;5×10~(-1)1×10~2的复性组份占70％。它们都没有明显百分数的迥折序列组份;快速复性组份的拷贝数低于10~6,相当于中度重复序列1;中、慢速复性组份则分别为中度重复序列Ⅱ和原拷贝序列。在快速复性部份,鲤鱼与鲫鱼之间表现出较大差异。此外,本文还就鲤鱼和鲫鱼的DNA复性动力学与鲤鲫移核鱼(cyc(?))F_3进行了比较。鲤鲫移核鱼DNA的复性动力学特征与其细胞核供体鱼(即鲤鱼)是相似的。这说明异源细胞核与胞质的结合没有导致核内DNA基因组结构出现明显变化。     

pBV220/hIL-4优化表达及其包涵体复性研究

旨在对人白细胞介素-4(hIL-4)上、下游序列进行优化设计,提高在原核系统中的表达量,并对表达的包涵体进行复性研究提高复性率.利用BioSun的RNA二级结构预测模块辅助设计hIL-4起始密码子(AuG)上、下游的序列,使局部二级结构的自由能满足高表达要求;根据pBV220栽体和原核系统的特点优化引物序列提高hIL-4原核表达量.优化hIL-4包涵体复性条件和方法,提高复性率和生物活性.结果显示,成功构建了pBV220/hIL-4高效表达栽体,原核表达的重组人IL-4占细茵总蛋白的35%以上,明显高于优化前表达量;经过复性研究hIL-4包涵体复性率可达到15%以上,生物活性鉴定发现,纯化的hhIL-4蛋白的比活等同或高于国外同类产品.影响原核表达的条件较多,对表达序列的优化设计可以大大提高蛋白的表达量.针对人IL-4基因序列的优化设计提高了人IL-4基因的表达,复性方法的改良提高了复性率和生物活性.     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95%以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80%以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

灰茶尺蛾核型多角体病毒大田防治条件的探索

为了经济有效地在大田应用EgNPV防治灰茶尺蛾 ,在室内进行EgNPV的毒力测定 ,试验表明致死中量LC50 为 1.13× 10 6PIB/mL ,90 %的致死量为 1.83× 10 7PIB/mL ,在 95%置信范围内 ,上限为 1.96× 10 7PIB/mL ,下限为 1.7× 10 7PIB/mL。用 2× 10 7PIB/mL浓度对不同龄期幼虫的感染试验表明 ,1 2龄效果最好 ,达 90 %以上。不同世代感染试验表明 :第 2、3、4、7代防治效果较好 ,高达 90 %以上 ,而第 5、6代效果不好 ,因此病毒增殖与大田防治工作应尽量避免在高温 ,干旱季节进行。另外探讨了适用大田防治的病毒增殖方法。     

重组人粒细胞集落刺激因子的表达、纯化以及PEG修饰

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经大肠杆菌温度诱导表达后,其表达产物以包涵体形式存在,包涵体经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到纯化的rhG-CSF.在一定的实验条件下用单甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)对rhG-CSF进行化学修饰,所得修饰产物经分离纯化后获得PEG20K-rhG-CSF偶联物.与修饰前的rhG-CSF相比较,尽管修饰后的rhG-CSF体外生物学活性下降至修饰前的20%左右,但其在体内的作用时间能够得到显著的延长,药效有了明显提高.     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184）融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95％以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80％以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

人血小板衍生生长因子BB亚型包涵体复性与纯化

目的:优化人血小板衍生生长因子BB亚型(PGDF-BB)包涵体复性方法与纯化条件,获得具有较好生物活性的重组PGDF-BB蛋白。方法:对PGDF-BB包涵体以梯度尿素进行变性,选择最佳包涵体变性浓度;比较不同复性条件下的复性率,稳定PGDF-BB包涵体复性方法;参照该蛋白的理化性质,选择适合PGDF-BB重组蛋白的纯化方法。结果:原核系统内实现了PGDF-BB的高表达;通过优化包涵体复性方法,重组蛋白的包涵体复性率可达40%以上;经过多个纯化方法相结合,PGDF-BB的纯度达到95%。结论:通过实验条件的优化,提高了PGDF-BB包涵体复性率,获得高纯度、高生物活性的重组PGDF-BB蛋白。     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a的制备及其在tPA突变体纯化中的应用

将基因工程菌株E.coliBL21(DE3) pET22b-mETIa高密度发酵,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa)蛋白在E.coli中得到较高水平表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上.经菌体破碎、包涵体变性、复性,二步柱层析纯化得到电泳纯的rETIa蛋白.测得rETIa对t-PA突变体(NTA)的抑制平衡常数K_i为8.72×10^－8 mol/L.据此利用纯化的rETIa蛋白制备rETIa-Sepharose 4B亲和层析柱.直接一步纯化NTA复性液,纯化的NTA纯度达90 %以上,收率为96.2 %,纯化倍数为13.2,比活为(565.7±71.3) U/μg.     

重组人粒细胞集落刺激因子发酵工艺研究

通过对大肠杆菌（E.coli）表达重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）工程菌DH5a的发酵工艺的研究,对影响工程菌生长和目标蛋白表达条件如：发酵培养基配方,pH值,诱导时间,分批补加营养物质等进行了优化。结果表明,采用优化的条件发酵后,工程菌得率达30g/L以上;目标蛋白表达量为30%以上。