厚壳贻贝新型抗菌肽myticalin和mytimacin的分子鉴定

从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)鳃组织中鉴定到一种新型贻贝肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein, PGRP)分子, 为探讨其在贻贝先天免疫系统中的作用, 对其开展了序列分析, 表达模式, 亚细胞定位, 原核重组表达及表达产物的功能验证研究。研究结果表明, 厚壳贻贝新型PGRP由438个氨基酸残基组成。序列中含典型肽聚糖识别蛋白/酰胺酶(PGRP/Amidase)结构域, 属于酰胺酶型PGRP。该蛋白在厚壳贻贝各组织中呈组成型表达特征。微生物胁迫可明显上调PGRP表达量, 其响应速度和表达量上调幅度对不同微生物胁迫具有差异。利用原核重组表达技术成功表达出可溶性重组厚壳贻贝PGRP。对表达产物的功能验证结果表明, 重组厚壳贻贝PGRP蛋白表现出明显的抑菌活性、细菌凝集活性和对PGN的酰胺酶活性, 上述活性均具有锌离子依赖性。亚细胞定位分析结果表明, 该PGRP分子主要定位于细胞核内。上述结果为深入了解厚壳贻贝的免疫识别机制奠定了基础。

     

厚壳贻贝新型抗菌肽myticalin和mytimacin的分子鉴定

从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)血细胞转录组数据中鉴定到两种新型抗菌肽, 分别为myticalin和mytimacin。为了解两种抗菌肽的结构与功能, 以及在贻贝免疫过程中的响应模式, 采用固相化学合成技术获得两种抗菌肽化合物, 在此基础上开展了抑菌活性测试, 红细胞毒性测试及对微生物抑制作用机理的扫描电镜观察。此外, 研究了贻贝在不同微生物诱导下, 两种抗菌肽的表达模式。研究结果表明, 化学合成的myticalin和mytimacin均具有抑菌活性, 但抑菌谱有所差异。两种抗菌肽尽管结构差异较大, 但对金黄葡萄球菌和溶藻弧菌的作用机制类似, 均能导致细菌表面形态结构发生变化。此外, mytimacin对白色念珠菌表现出明显抑制作用, 且其作用机制不同于金黄葡萄球菌和溶藻弧菌, 能导致白色念珠菌表面出现孔洞, 而myticalin则无此现象。两种抗菌肽在不同微生物诱导后, 其表达量均明显上调, 但myticalin表现出对革兰氏阳性菌诱导的敏感性, 而mytimacin表现出对真菌和革兰氏阳性菌诱导的敏感性。研究为深入了解贻贝抗菌肽的分子多样性及其抑菌活性机制, 以及贻贝抗菌肽的分子工程研究奠定了基础。     

一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分;经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域（Chitin-biding domain）,因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量PCR检测表明,mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。     

厚壳贻贝一种新型贝壳胶原蛋白的重组表达与功能分析

贝壳是一种具有优异力学性能的生物硬组织,贝壳基质蛋白质对贝壳的形成具有重要意义。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)贝壳中发现一种类似胶原蛋白质的新型贝壳基质蛋白质,命名为collagen-like protein 2（CLP-2）。然而,该蛋白质的结构与功能以及对贝壳形成的影响机制尚不清楚。为此,本研究对CLP 2开展了序列分析;进一步采取密码子优化结合原核重组表达策略,开展了CLP-2的重组表达;在此基础上分析了重组CLP-2对酸钙结晶的诱导、结晶速率抑制以及碳酸钙结合能力。对CLP-2的序列分析结果表明,该蛋白质序列中含有信号肽及两个Von Willebrand factor A（VWA）结构域。CLP-2在数据库中尚无高同源性蛋白质存在,表明这是一种较为新颖的贝壳基质蛋白。所获得的重组CLP-2对碳酸钙体外结晶表现出明显的诱导作用,扫描电镜以及傅里叶红外光谱结果表明,重组CLP-2可诱导碳酸钙晶体的形貌由立方体形转化为球形,并在高浓度下进一步转化为哑铃形;同时,重组CLP-2可促使碳酸钙晶体的晶型由方解石型向文石型转化;重组CLP-2在体外具有碳酸钙晶体结合作用;此外,重组CLP-2能显著抑制碳酸钙晶体的结晶速度（P<0.01）,并具有浓度依赖性。上述结果表明,厚壳贻贝贝壳CLP-2蛋白质在贝壳,特别是文石型肌棱柱层的生物矿化过程中具有重要作用。上述研究为深入了解贻贝贝壳的形成机制,以及胶原类蛋白质对生物矿化过程的影响奠定了基础。     

厚壳贻贝外套膜对细菌肽聚糖胁迫的代谢响应

为了解贻贝(Mytilus)外套膜免疫相关机制, 对贻贝进行肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)胁迫, 并利用超高压液相色谱−质谱联用技术, 对贻贝外套膜在PGN胁迫后48h的代谢物组成及含量进行组学鉴定, 同时对胁迫前后的外套膜组织开展了游离氨基酸组成, 外套膜黏液抑菌活性及抗氧化能力分析。结果表明, PGN胁迫导致贻贝外套膜部分代谢物含量发生显著变化(P<0.05), 从中共鉴定到486种差异代谢物, 包括232种上调和254种下调代谢物; 其中, 上调差异代谢物主要富集于细胞信号转导及氨基酸代谢相关途径, 而下调SDM主要富集到脂质代谢和维生素代谢相关途径。此外, PGN胁迫导致外套膜中过氧化氢酶活力上调(P<0.05), 并导致外套膜黏液对枯草芽孢杆菌的抑制率显著上升(P<0.05)。研究为深入了解贻贝应对免疫胁迫的分子策略, 以及贻贝健康养殖奠定了基础。     

利用质谱技术结合EST库搜索鉴定厚壳贻贝新型足丝蛋白

贻贝利用足丝粘附于水下各种基质表面.作为一种具有优异粘附性能的生物材料,贻贝足丝蛋白在新型水下粘附剂及表面保护涂层的研制与开发中具有重要的仿生学意义.目前,已报道的贻贝足丝蛋白分子达11种,但是仍然有更多的足丝蛋白分子不为人知.为进一步探讨贻贝足丝蛋白的分子多样性,并从中筛选具有特殊生物学功能的足丝蛋白分子,本文采用鸟枪法-液相色谱-质谱/质谱技术（shotgun-LC-MS/MS）对厚壳贻贝足丝蛋白进行了蛋白质组学分析.将厚壳贻贝足丝分为足丝纤维和足丝盘两部分,每一部分均采用醋酸-尿素溶液,以及醋酸-盐酸胍溶液进行蛋白质抽提;抽提后的足丝蛋白经胰蛋白酶酶解,利用线性离子阱四级杆质谱（LTQ）进行鸟枪法质谱分析.二级质谱图（MS/MS）用以搜索公共数据库中的贻贝表达序列标签（expressed sequence tag,EST）数据库.采用上述方法,获得14种贻贝新型足丝蛋白的高可信度结果及其所匹配的部分或全长cDNA序列;经结构域分析,发现上述新型贻贝足丝蛋白分子的序列中多数包含各种类型的结构域,包括胶原蛋白结构域、C1Q结构域、C1Q结合结构域、微管蛋白辅助折叠结构域、蛋白酶拮抗结构域、VWA结构域、几丁质酶结构域等.在此基础上,对上述新型足丝蛋白在贻贝足丝形成以及粘附方面的功能进行了推测.上述结果对进一步了解贻贝足丝的分子组成以及粘附机理奠定了基础.     

厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的初步鉴定(英文)

足丝蛋白是贻贝科(Mytilidae)所特有一种在水环境中也能表现出强黏附功能的蛋白,也是目前开发新型生物黏附剂的主要候选分子。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部沿海,是我国具有重要经济价值的贻贝,其足丝粗硬,黏附力强,关于厚壳贻贝的足丝蛋白的研究目前尚未见报道。通过醋酸抽提结合反相高效液相色谱分离,从厚壳贻贝足丝盘中分离纯化到数种低分子量足丝蛋白,经质谱鉴定和氨基酸序列测定,其中三种足丝蛋白(分子量6 kD左右)属于贻贝足丝蛋白-3(mytilus foot protein-3,mfp-3)家族,且序列中富含DOPA,另有三种足丝蛋白为未知新型足丝蛋白。石英晶体微天平分析表明,厚壳贻贝低分子量足丝蛋白在金表面有较强的吸附能力,这与其黏附功能是直接相关的。以上工作为深入了解厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的分子多样性以及黏附机制奠定了基础。     

壳损伤及海水酸化对厚壳贻贝脲酶和碳酸酐酶的影响

海洋酸化是当前全球面临的最为紧迫的环境问题之一,已显现出对具生物矿化现象物种的严重影响。以往研究发现,贻贝表现出对海洋酸化较强的耐受性。为探究贻贝对海洋酸化耐受性的可能机制,选择两种对生物矿化具有重要影响的酶(碳酸酐酶和脲酶)为研究对象,分析其在壳损伤以及酸化海水条件下基因表达量和酶活力的变化;进一步对上述条件下的贻贝贝壳内表面开展了显微观察。研究结果表明,相比对照组,壳损伤或酸化海水处理诱导碳酸酐酶和脲酶的基因表达量产生不同程度的上调(P<0.05),酶活力测试与基因表达量分析结果具有类似特征,但存在时序性差异。而壳损伤叠加海水酸化处理则诱导碳酸酐酶和脲酶的基因表达量及酶活性在外套膜中均明显下调(P<0.05),但碳酸酐酶在血细胞中明显上调(P<0.05);在酸化海水中添加尿素则明显上调血细胞和外套膜中碳酸酐酶和脲酶的基因表达量以及酶活性(P<0.05)。贝壳内表面显微观察结果进一步表明,海水酸化及壳损伤导致损伤部位附近的贝壳内表面产生明显纹理质地改变,尿素可诱导海水酸化条件下壳损伤部位修复层的重新出现。上述结果表明,碳酸酐酶和脲酶可能参与了对壳损伤修复及海洋...     

猪防御素PD基因表达载体的构建

目的：构建猪防御素PD基因表达载体。方法：化学合成经过适当改造的带有双酶切位点的PD基因,将该基因定向插入带有相同酶切位点的融合表达质粒PinPoin^TMXa-3的多克隆位点构建表达质粒。结果：构建的表达载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,表明PD基因表达载体构建成功。结论：PD基因表达载体的构建,为进一步获得PD基因的表达产物,研究其抗菌活性、抗菌机理打下基础。     

β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

为了研究抗菌肽β-防御素130的生物学活性和实现大规模制备,通过改良其分子结构,构建表达载体pET28a-3×β-defensin130,利用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主细胞诱导表达后为水溶性蛋白。对纯化后抗菌肽进行抑菌实验、稳定性实验、MTT实验和溶血性实验确定其生物活性。最终成功制备出25 kDa的重组蛋白,对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(45μg/mL)和单增李斯特菌(ATCC221633)(80μg/mL)等革兰氏阴性和阳性菌都表现出极强的抗菌活性,且其抗菌活性不受温度、pH值和蛋白酶消化等影响,MTT细胞毒性实验显示其对HEK293细胞无毒性且对兔源红细胞具有极低的溶血性。这将为新型抗菌肽的开发提供理论基础并推动抗生素替代产业快速发展。     

人防御素的研究进展

人防御素是近年发现的人体内重要的内源性抗生素,已引起国内外生物和医学研究者的日益重视。这里综述了人防御素的组织分布、分子生物学特点、作用机理、医学及药用价值等方面的研究进展,对采用基因重组方法生产人防御素的方法进行了评述,并展望了防御素的应用前景和发展趋势。     

Amino Acid Sequence and Antimicrobial Activity of Chitin-Binding Peptides,Pp-AMP 1 and Pp-AMP 2, from Japanese Bamboo Shoots (Phyllostachys pubescens)

Two novel chitin-binding peptides, designated Pp-AMP 1 and Pp-AMP 2, which had antimicrobial activity against pathogenic bacteria and fungi, were purified from Japanese bamboo shoots (Phyllostachys pubescens) by a simple procedure based on chitin affinity chromatography. They had the common structural features of the plant defensin family, but they could not be grouped in any type of that family. They showed a high degree of homology to mistletoe toxins.     

复合抗菌肽PL在毕赤酵母中的分泌表达及其活性研究

为了获得抗菌活性较强的抗菌肽,将几种抗菌肽串联起来在毕赤酵母中表达,并比较其与单独抗菌肽的抑菌活性。以GenBank中的Protegrin-1(PG-1)、ScorpionDefensin(SD)、Metalnikowin-2A和SheepMyeloidAntibacterialPeptide(SMAP-29)(序列号分别为AAB27599,AAAB27538、P80409和P49928)成熟肽段作为模板序列,根据巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)偏好密码子,设计并人工合成复合抗菌肽pl基因,同时用SOE法获得ScorpionDefensin的基因,分别克隆到pPICZαA载体中,转化P.pastoris受体菌X-33,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,复合抗菌肽PL及SD均获得表达。体外抑菌试验检测复合抗菌肽PL与单独的蝎子防御素SD的热稳定性、酸稳定性、最低抑菌浓度等,结果显示复合抗菌肽PL及SD具有很强的热酸稳定性,而针对不同的细菌,复合抗菌肽则表现出了强于单独的SD的活性,特别是对大肠杆菌。上述结果说明了该复合抗菌肽具有很好的开发前景。     

Investigation of Volatile Components in Wines from Koshu and Zenkoji Grapes

A 3-hydroxyethyl-4-cyanoazetidin-2-one derivative (2) was synthesized from (2R,3R)-potassium 2,3-epoxybutyrate through two steps, and it was then further converted to a diazo derivative (7).     

Synthesis and structure-activity relationship of beta-defensins, multi-functional peptides of the immune system.

beta-defensins are a large family of multiple disulfide-bonded peptides occurring in mammals and birds. They play an important role in the innate immune system, directly killing microbial organisms. Recent research has demonstrated that beta-defensins are important for other biological functions beyond antimicrobial effects, including inhibition of viral infection, interaction with Toll-like receptors, chemotactic effects, and sperm function. The corresponding broad spectrum of activities makes this peptide class an important subject and tool in immunologic research. In this review, we summarize the current status of the routes to obtain synthetic beta-defensins, their major structural properties and structure-activity relationship.