电化学发光PCR方法检测结肠癌中K-ras癌基因点突变

发展了一种可用于快速检测K-ras癌基因点突变的电化学发光PCR(ECL-PCR)分析方法,该法采用三联吡啶钌标记的上游引物和生物素标记的下游引物对目的片段进行PCR扩增;随后,采用限制性内切酶MvaI对扩增产物进行酶切,由于突变导致酶切位点的丢失,所以只有野生型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接,将生物素标记的DNA片段收集到反应池中进行电化学发光检测。采用该法对20例结肠癌组织中的K-ras癌基因第12位密码子进行点突变分析,得出其中有9例存在点突变,点突变率为45%。该方法操作简便、安全、快速、灵敏,可用于快速检测K-ras癌基因点突变。     

电化学发光在基因检测中的应用

电化学发光基因检测是把电化学发光的高灵敏性和传统分子生物学方法的稳定性结合于一体的一种新型的基因检测技术。与传统的基因检测方法相比,它具有无放射性危害、高灵敏度、操作简便等优点。近年被广泛地应用于核酸序列分析,基因突变分析,遗传病、转基因物种、病毒、微生物等的检测。本文概述了电化学发光的基本原理以及传统的基因检测技术,详细地介绍了电化学发光在当前基因检测中的应用现状,并对其前景作了展望。     

高灵敏度电化学发光PCR方法检测花椰菜花叶病毒35 S启动子

大多数转基因植物中使用花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35 S作为启动子,因此可通过检测该启动子来判断植物样品中是否含有转基因成分。实验将高灵敏度电化学发光PCR方法用于检测转基因烟草中的CaMV35 S启动子,将该启动子的PCR产物与生物素标记的探针杂交,可以起到特异性筛选产物的作用;与发光标记物——三联吡啶钌标记的探针杂交,从而实现电化学发光检测。两种探针同时与待测样品的PCR产物进行杂交,进一步对样品进行特异性筛选,从而提高了检测的准确性,避免了假阳性结果的产生。实验结果表明:该法可以准确的区分待测样品中是否含有35 S启动子,从而区别转基因烟草和非转基因烟草。电化学发光PCR方法灵敏度高,可靠性强,操作简便,结果准确,有望成为一种高效的转基因植物检测方法。     

PCR－SSCP技术在基因点突变检测中的几种策略

ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术在基因点突变检测中的几种策略王吉伟,罗赛群（湖南医科大学分子生物学研究中心,长沙４１００７８）关键词ＰＣＲ－ＳＳＣＰ,点突变检测基因点突变的检测对于分子种群生物学的研究、遗传性疾病预测及分子水平的临床诊断等颇具实用价值。在众多的测...     

优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变

利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点,国内外文献未见其方法学的系统报道.以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR,针对影响重叠PCR扩增的拼接类型,引物设计,反应条件等进行优化.结果表明两段重叠连接比三段更容易实现,且扩增效果好;引物的互补序列长度一般应大于15 bp,且在18～24 bp 时扩增效果最好;退火温度在52～60℃,Mg2+浓度在1.5～2.5 mM时对拼接的效果影响较小;直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增.利用优化策略,首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变,为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础.     

猪雌激素受体基因（ESR）点突变的PCR－SSCP检测

雌激素受体基因(ESR)是控制猪高产仔数的主效基因之一,具有明显的基因效应:BB型比AA型母猪胎总产仔数和产活仔数分别高出1.40～3.37和0.63～3.58头,是目前商品猪育种和生产中重点检测的主要基因之一。常规采用PCR－RFLPs方法区分该基因由点突变造成的3种不同的基因型。本研究建立1种基于PCR的SSCP(single－stranded conformation polymorphism)方法对猪ESR该位置的点突变进行检测,具有操作简便、灵敏度高和不需要酶切等优点,可以在育种实践中广泛应用。 Abstract:ESR is a major gene controlling litter size in swine.The sows of BB genotype produce 1.40～3.37 more piglets of the total number born and 1.07～2.40 piglets of the number born alive respectively comparing with those of AA genotype.ESR has been one of the widely detected genes in pig breeding and production.Usually the point mutation of ESR gene was detected by PCR-RFLP approach.The present study established a novel method based on PCR-SSCP,with the advantage of easy maniputation,high sensitivity and no necessity for restriction enzyme digestion.This method may be applied for commercial detection of the point mutation of ESR gene in swine breeding.     

电化学发光PCR技术检测转基因植物

随着转基因植物种类的增多,转基因植物的检测也成了当今的热门话题.电化学发光法是将电化学与化学发光两种高灵敏度方法相结合,实现了检测的高效、准确、无毒害.电化学发光PCR法首次将电化学发光技术、PCR技术和双探针杂交技术结合起来,用于检测CaMV(cauliflower mosaic virus)35 S启动子,从而判断其是否含有转基因成分.PCR产物与生物素标记的探针杂交,可以起到筛选的作用;与三联吡啶钌标记的探针杂交则可用于电化学发光检测.两种探针同时与转基因样品PCR产物杂交,使结果避免假阳性的影响而更加准确.实验表明：此方法可以准确地检测到35 S启动子的存在.该方法灵敏度高,可靠性强,操作简便,结果准确,有望成为一种高效的转基因检测方法.     

PCR－SSCP检测肺癌细胞p53基因点突变

应用溴化乙锭(EB)染色的PCR-SSCP技术对10例非小细胞性肺癌组织标本p53基因外显子5～8进行分析,其中1例在外显子5～6;1例在外显子7;2例在外显子8发现异常电泳带.对1例经SSCP检测异常的p53基因进行核酸序列分析,发现第280位密码子由AGA变成ACA,其编码的氨基酸由丝氨酸变成半胱氨酸.结果证实:非小细胞性肺癌与p53基因突变有关;EB法PCR-SSCP技术是一种简便、可靠的点突变检测法.     

双链DNA 膜效应在序列点突变电化学检测中的应用

报道一种基于金表面的双链DNA膜效应检测DNA点突变的新方法。致密的双链DNA分子层可以将电化学信号分子禁闭在金表面和双链DNA之间,或者将信号分子与金表面隔离开,使其无法接触裸金面．在实验系统中采用Fe(CN）6^3-为信号分子,在升高温度时,双链DNA膜被破坏,信号分子离开或接触金表面,解链曲线会出现一个陡峭的电化学信号变化。在特定的温度下,完全互补的序列和单碱基点突变的序列的信号比达到了100：1。这种方法简单而且灵敏,同时避免了复杂的共价修饰信号分子的过程。     

一种测定癌基因c-Ha-ras点突变的简易方法——PCR-RFLP法

利用多聚酶DNA链延伸反应与限制性内切酶酶解片段长度多态性分析相结合,可简单、迅速、准确地对胃癌组织及细胞株DNA中癌基因c-Ha-ras第12位密码子是否存在点突变进行测定。这个方法是使用非同位素方法对单拷贝基因点突变进行检测的首次报道。     

基于核酸侵入反应的基因突变检测方法研究进展

肿瘤靶向药物治疗需要检测特异性的基因突变。尽管已开发出多种基于模板扩增的基因突变检测方法,但由于存在扩增产物交叉污 染的风险,其应用受到极大限制。基于信号扩增的核酸侵入反应,由于不存在扩增产物污染的风险,并且具有良好的单碱基识别特异性, 非常适用于基因突变的检测。因此,一系列基于核酸侵入反应的基因突变检测方法应运而生。综述若干基于核酸侵入反应的基因突变检测 方法原理与应用研究。     

一种检测细胞微量点突变的方法——等位基因特异的PCR

为了灵敏、方便地检测出细胞群体中含量极低的点突变,利用一β珠蛋白基因簇Gγ -202 C→G突变的杂合细胞株,优化传统的等位基因特异PCR的反应条件,以定量的PCR产物为模板,在含5%甲酰胺的体系中用半巢式的等位基因特异引物进行扩增.结果表明,该方法灵敏可靠,可快速检测到细胞群体中低于0.025%的点突变.     

两种等位基因特异性扩增方法在结肠癌K-ras癌基因点突变检测中的应用比较

针对传统电泳检测方法存在操作复杂、费时等缺点,提出一种用于检测K-ras癌基因点突变的实时荧光等位基因特异性扩增（Allele specific amplification,ASA）方法。该法采用突变型引物对结肠癌基因组中的K-ras基因进行等位基因特异性扩增,只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物,该产物能与双链DNA染料SYBR GreenⅠ结合,产生荧光信号从而被检测到。通过对荧光域值和溶解曲线分析来区分不同的基因突变类型。该法可以检测到野生型DNA中含量为1/1 000的突变型DNA,整个检测时间小于1 h。我们用该法检测31例结肠癌样品中K-ras基因密码子12发生的点突变,其中有15例检出为阳性。此外,还采用等位基因特异性扩增结合电泳分析对样品进行了检测,并对两种方法进行了比较。结果显示：实时荧光等位基因特异性扩增方法具有操作简便、快速、检测成本低等优点,为临床诊断基因突变引起的疾病提供了一种可行的手段。     

A method to quantitatively detect H-ras point mutation based on electrochemiluminescence

Conventional methods for point mutation detection are usually multi-stage, laborious, and need to use radioactive isotopes or other hazardous materials, and the assay results are often semi-quantitative. In this work, a protocol for quantitative detection of H-ras point mutation was developed. Electrochemiluminescence (ECL) assay was coupled with restriction endonuclease digestion directly from PCR products. Only the wild-type amplicon containing the endonuclease's recognition site can be cut off, and thus cannot be detected by ECL assay. Using the PCR-ECL method, 30 bladder cancer samples were analyzed for possible point mutation at codon 12 of H-ras oncogene. The results show that the detection limit for H-ras amplicon is 100 fmol and the linear range is more than three orders of magnitude. The point mutation was found in 14 (46.7%) out of 30 bladder cancer samples. The experiment results demonstrate that the PCR-ECL method is a feasible quantitative approach for point mutation detection due to its safety, high sensitivity, and simplicity.     

宫颈癌c-Ha-ras癌基因点突变的研究

用聚合酶链反应放大技术扩增宫颈癌e-Ha-ras癌基因第一外显子的基因片段,反应终产物与5′末端标记的特异寡核苷酸探针杂交,在18例宫颈癌DNA样品中,发现有6例存在e-Ha-ras癌基因第12位密码子的G-T突变,突变率为33％。推测第12位密码子的点突变是宫颈癌Ha-ras基因的活化途径之一。