医药其它

930930 .组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子■组Kringlel区的表达、纯化及鉴定[英]/Deserrano,V.S.…,Arch.Bioehem.Biophys.·1992,294(1)..282"~290[译自DBA,1992,11(17),92.09686] 用新的融合蛋白表达质粒pST II(KZHPg)pfXa(KltPA)在大肠杆菌中表达纯的人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)kringle 1区(Ki tPA)残基C92~C173。该质粒顺序编码了人血纤维蛋白溶酶原的紧密赖氨酸结合kringle(K)1区(KIHPg),及含因子-Xa敏感键的肽(pfXa),在其下游插入K1tPA。经Sepharose-赖氨酸亲和层析从大肠杆菌DHs-a细胞的各种级分中纯化出…     

组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体——长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将它插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAtPA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,再将所构建的BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和Southern印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的9只F1代子鼠中,有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1～2μg/ml,BLGtPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β-乳球蛋白基因(BLG)作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工具,构建了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,经PCR和Southern\|Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG-tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汁中检测到tPA的活性,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合在小鼠基因组中的牛BLGtPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

重组人纤溶酶原激活剂转基因兔的制备及其表达产物的检测

人组织纤溶酶原激活剂(ht-PA)是临床血栓疾病治疗的主要生物药品,应用转基因动物乳腺生物反应器制备已有报道,但重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)在转基因动物中表达尚未见报道。设计了以人t-PA的F、E、K1区位点缺失体为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子,构建了乳腺特异性表达载体PCL25/rh PA,通过受精卵原核显微注射法制备转基因兔。用PCR检测及其产物测序筛选转基因兔,ELISA试剂盒及纤维蛋白平板溶圈法检测转基因兔的表达产物。实验获得原代转基因兔5只(2♂,3♀),其中2只乳腺中表达人重组纤溶酶原激活剂,rh PA浓度最高可达400μg/m L,表达产物比活性是现有阿替普酶的150-200倍。实验结果表明,重组人纤溶酶原激活剂(rh PA)可以在山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动/增强子调控下获得乳腺特异性表达,表达重组蛋白具有较高的溶栓活性。     

转基因小鼠乳腺表达长效组织纤溶酶原激活剂

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将其插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAt-PA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,将此构建BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和DNA印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的F1代子鼠中,9只中有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1-2μg/ml,说明BLG-tPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。为今后利用牛、羊作为生物反应器表达LAtPA奠定了基础。     

利用CMV启动子在CHO细胞中表达人tPA

人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是一种以丝氨酸为活性中心的蛋白酶,它能使特异地与血栓中纤维蛋白结合的纤溶酶原转变为纤溶酶,从而选择性地溶解血栓中的纤维蛋白,因此在临床上具有重要的应用价值。为适于tPA基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的高效表达,将tPA cDNA片段从原来获得的重组质粒pMM6005中用HindⅢ和BamHⅠ酶切出,经Klenow酶补平后插入CMV启动子下游     

激素和活性多肽

利用位点定向诱变产生3个突变,即分裂了一个离子对,在Arg-30和Glu-350(P4')之间出现潜在血纤维蛋白溶酶原激活因子     

tPA/gGH双基因转染山羊乳腺上皮细胞表达分析

人组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)是一种被广泛应用于临床的溶栓药物。双基因共整合入生物体内能够产生协同作用,从而提高目的基因的表达水平。但是目前,利用gGH基因与tPA基因共整合以期提高tPA表达水平的相关研究较少。为筛选获得tPA高表达的tPA/gGH双基因整合的单克隆转基因山羊乳腺上皮细胞株,本研究以β-casein基因作为调控序列,构建乳腺特异性表达载体PCL25/gGH,并通过电转染将tPA和gGH双基因共转染山羊乳腺上皮细胞;通过G418筛选获得抗性细胞株,经PCR检测获得转基因单克隆细胞株;利用催乳素诱导tPA表达,收集48 h后细胞诱导液进行ELISA()和Western blotting检测并分析其tPA表达水平。结果表明,共获得142株抗性单克隆细胞,其中有53株tPA单基因整合细胞株,34株tPA/gGH双基因整合细胞株,双基因整合率达23.9%(34/142)。共检测出29株细胞能够表达tPA,其中单基因表达细胞为12株,表达率为22.6%(12/53);双基因表达细胞为17株,表达率为50.0%(17/34);且单基因细胞表达tPA含量为7.5~52.0μg/mL,而双基因细胞表达tPA含量为40~360μg/mL,明显高于单基因表达水平。本研究通过电转染的方式成功获得了tPA/gGH双基因整合的单克隆山羊乳腺上皮细胞株,并证明双基因整合的细胞株表达tPA水平明显提高,为后期制备高表达转基因山羊奠定了基础。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA的克隆

组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plas-minogen activator,tPA)是一个由527个氨基酸残基组成的蛋白质,分子质量约69ku。 tPA是一种丝氨酸蛋白水解酶,在纤维蛋白存在的条件下,可使血浆纤溶酶原转变为纤溶酶;如果没有纤维蛋白的存在,它使纤溶酶原转变为纤溶酶的能力有限。当静脉给予药理剂量的tPA时,它与血栓处的纤维蛋白结合,同时把捕捉的纤溶酶原转变为纤溶酶,使纤维蛋白的溶解在血栓处发生,而并非全身性。这样可以减少全身性出血副作用,这也更是tPA优于尿激酶和链激酶之处。tPA临床上主要用于治疗血栓性疾病,如急性心肌梗塞,肺栓塞,视网     

ＢＬＧ—ＬＡtPA和鼠ＷＡＰ共注射提高ＬＡtPA在转基因小鼠乳腺中的表达水平

为了提高长效组织纤溶酶原活剂（ＬＡtPA）在转基因小鼠乳腺中的表达水平,将受控于羊β－乳球蛋白（ＢＬＧ）的ＬＡtPA表达载体ＢＬＧ－ＬＡtPA与小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因片段进行共注射,采用此方法建立的转基因小鼠,经ＰＣＲ筛选和Ｓouthern印迹鉴定,获得３只ＬＡtPA和ＷＡＰ共整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的ＬＡtPA表达,表达水平达到１０μg/mL。     

小鼠输精管内转染法建立人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺定位表达生物反应器的研究

外源基因受精卵内显微注射目前仍然是种常用的建立转基因动物的方法,但此方法操作复杂,成本高。因此利用精子作为载体将外源基因带入卵细胞内建立转基因动物成了极具吸引力的方法,并且已有一些成功的报道。虽然该方法简单,但总体来说可重复性较差。我们在建立乳腺定位表达人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)小鼠模型中,对此方法做了改进,即将脂质体包裹的外源基因在小鼠输精管及附睾管内转染精子,而非以往的在体外转染,结果:(1)五只转染小鼠,术后10天内共使10只正常母鼠受精;(2)共繁殖出79只首建者小鼠,存活42只;(3)用PCR检测首建者小鼠外源基因的整合,阳性率为7/42(16.67%);(4)用凝胶平板溶圈试验检测5只PCR阳性的雌性首建者小鼠泌乳期乳汁中的活性tPA,3/5表达,表达量在12—20IU/ml之间(约相当于48—80ng/ml);(5)PCR检测4只子一代小鼠外源基因的遗传情况,阳性率为2/4。     

卵巢纤蛋白溶酶原激活因子及其抑制因子的研究

本文综述了近年来作者在研究卵巢纤蛋白溶酶原激活因子(PA)及其抑制因子(PAI)的某些成果。PA是一种高效能蛋白水解酶激活因子,它激活纤蛋白溶酶原成为纤蛋白溶酶,此酶在纤蛋白水解过程中起重要作用。已有证据表明,PA与排卵有关。我们进一步研究发现:(1)在大鼠卵巢体细胞中存在两种PA,即组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA);而在卵细胞中只发现tPA;(2)大鼠卵巢tPA明显受促性腺激素和其他激素调节,并在排卵前达到高峰,而uPA没有明显变化;(3)在卵巢体细胞中还发现一种PA的抑制因子(PAI),它与PA结合形成复合体,能部分或完全消除PA活性;(4)只有tPA与大鼠排卵有关;PA和PAI间的相互作用和随激素的波动而引起的动态变化可能对维持卵巢正常生理功能和排卵起重要作用。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β－乳球蛋白基因（BLG）作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工龄,构建了组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,以PCR和Southern-Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG－tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汗中检测到tPA r itd ntg ,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合的小鼠基因组中的牛BLG－tPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

用色原及凝溶试验法测定组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)的效价

<正>组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)是一种限定特异性的丝氨酸蛋白酶,它是纤维蛋白溶酶系统最重要的生理激活剂。在血纤维蛋白存在时,TPA催化酶原纤维蛋白溶酶原转化成它的活性形式,血纤维蛋白溶酶。在体内,血纤维蛋白溶酶的主要目标是纤维蛋白。纤维蛋白溶解方面的最新进展导致了免疫反应TPA和催化部位TPA的敏感试验法的发展。测量催化活性的TPA试验似乎依赖于纤维蛋白原/纤维蛋白碎片的存在,这些碎片是用溴化     

猕猴精浆纤溶酶原激活因子的来源及在精子获能中的作用

我们的前期工作表明,不育症人精液中纤溶酶原激活因子（plasminogen activator;PA）活性明显升高;给成年办和猕猴注射长效睾酮诱发无精过程中,精液PA含量也伴随上升,为进一步查明PA的来源和对精子的作用,原位杂交检测组织型PA（tPA）,尿激酶型PA（uPA）及PA抑制因子－1（PAI-1)泊mRNAs在成年健康猕附睾、前列腺和精囊中的表达。体外培养猕猴精子,培液中加入uPA、tPA及其底物纤溶酶原（plasminogen）,测试PA对精子活力、顶体反应及激活卵子的影响。结果表明,猕猴附睾、前列腺和精囊均表达tPA、uPA和PAI-1 mRNAs。加入uPA能维持精子的活力,使精子产生超激活运动,诱导顶体反应的发生,并使精子获得激活卵子的能力,这说明猕猴精浆PA除来源于睾丸外,可能主要来源于附睾及附性腺;在体外,uPA,而不是tPA,可能诱导精子获能。     

大鼠卵巢细胞分泌纤溶酶原激活因子抑制因子(PAI-1)的激素调节

哺乳动物卵巢合成两类纤溶酶原激活因子(PA),即组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA)。大鼠卵巢除主要合成tPA外,还分泌一种纤溶酶激活因子的抑制因子(PAI-1)。在促性腺激素作用下,卵巢tPA和PAI-1两种基因的协调表达是导致滤泡破裂的原因。本实验进一步证实,卵巢中的PAI-1主要由膜-间质细胞分泌,可能作为一种屏障限制颗粒细胞tPA分泌到滤泡外间质。当排卵来临时,两种细胞所分泌的tPA和PAI-1相互作用后仍发现有大量tPA活性。这可能是引起排卵的主要原因。因为成熟的卵丘细胞除分泌高量tPA外,还分泌大量PAI-1,在人工授精中两者有可能作为鉴定卵子优劣的可靠指标。     

突变作用使TPA抗血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂

美国德克萨斯大学西南药物中心(达拉斯)的研究者们,利用定点突变作用使组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子(TPA)的结构发生了改变,有效地延长了其半衰期.这种改进的TPA使该酶对由血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂-1(PAI-1)所引起的抑制作用的敏感性大幅度下降,因而延长了TPA激活血块消散酶血纤维蛋白溶酶原的能力.     

转基因动物即将在奶里产生药用蛋白

目前,在农场上到处是披着羊皮和牛皮的潜在生物反应器,至少那些正在开发转基因动物的公司是这么认为的。这些想法究竟能否实现,现有两家公司在此方面迈出了第一步。 Tufts大学兽医学院(North Grafton,MA)和Genzyme Crop(Boston,MA)研究人员声称,首次获得了遗传工程羊,这种工程羊在羊奶里能产生人体药用组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(TPA)。他们将乳房对照DNA和编码TPA的DNA结合成杂种基因,然后将其微注射到羊受精卵里,待羊哺乳时分泌出TPA。受精卵又转移到代孕母羊体内,检测子羊体内杂种基因的存在。接着,将携带杂种基因的羊     

转基因山羊在其乳汁中表达单克隆抗体

Genzyme Transgenics Corp(Framingham,MA)已证实,转基因山羊可在乳汁中产生复合单克隆抗体(MAb);该公司与Bristol-Myers Squibb Co.(BMS) (Princeton,NJ)签定一项协议,使养育在马萨诸塞州农场的这些转基因山羊表达BMS的抗癌BR96 Mab。 Genzyme Transgenic公司已经证实,可以在山羊乳汁中高水平表达人抗-凝集蛋白抗-凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)。它还证明,如果按相同的遗传工程方法处理小鼠胚胎,转基因小鼠也可在其乳汁中产生     

单链尿激酶型纤溶酶原激活物的结构和性质

单链尿激酸型纤溶酶原激活物(scuPA)是一种丝氨酸蛋白酶,由411个氨基酸组成单一多肽链结构,是尿激酶的前体形式。它可特异地激活血栓局部的纤溶酶而启动纤溶系统,并与组织型纤溶酶原激活物(tPA)有协同作用,是一种有广泛前途的溶栓物质。