烟草赖氨酸脱羧酶基因NtLDC1的克隆和表达分析

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)是生物碱合成第一步所需的关键酶。为研究LDC基因在烟草中特性和功能,本研究采用同源克隆和RT-PCR方法从栽培烟草‘K326’中克隆得到一个LDC基因,命名为Nt LDC1,Gen Bank登录号为KU507075。序列分析表明烟草Nt LDC1基因ORF全长666 bp,编码221个氨基酸的蛋白,相对分子质量为24 264.9 Da,等电点为5.43。不同植物中LDC蛋白较为保守,Nt LDC1与番茄和马铃薯的LDC蛋白高度相似,进化分析表明Nt LDC1与番茄中LDC的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR对Nt LDC1基因进行组织表达分析,结果显示Nt LDC1基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,在叶片中的表达水平最高。低温可以诱导Nt LDC1基因的表达,在低温处理8 h基因的表达量达到最高,表明Nt LDC1可能在烟草低温胁迫应答中发挥作用。     

甜瓜CmERFIII-1转录因子基因cDNA的克隆与表达分析

根据甜瓜ERF亚家族成员聚类结果,选取第三亚群的Cm ERFIII-1(甜瓜基因组数据库登录号MELO3C005465)基因为研究对象,根据其c DNA序列设计基因特异引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜果实的总RNA中克隆得到Cm ERFIII-1基因c DNA,序列长711 bp,编码236个氨基酸组成的多肽。序列比对及系统发育分析表明,Cm ERFIII-1 c DNA编码的蛋白质氨基酸序列与黄瓜中ERF亚家族两个成员的序列(Gen Bank登录号:XP_004143677.1、XP_004158119.1)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甜瓜根、茎、叶和授粉后不同时期果实中均有不同程度表达,在叶片中表达量最高。     

烟草NtMAX4-1基因的克隆及特征分析

类胡萝卜素裂解双加氧酶8(CCD8或MAX4)在独脚金内酯合成中发挥重要作用,进而调控植物侧枝的发生。烟草生产过程中,控制腋芽是一项基本的措施。克隆腋芽控制基因从分子水平上为研究腋芽萌发和抑制其生长提供了靶标。本研究克隆了烟草Nt MAX4-1基因的全长c DNA,对其编码蛋白的理论等电点、分子质量、二级结构、亚细胞定位等特性进行了预测。Nt MAX4-1蛋白含有MAX4蛋白特有的视网膜色素上皮细胞膜蛋白保守结构域,多序列比对及进化树分析表明Nt MAX4-1蛋白与番茄MAX4蛋白遗传距离最近。另外,对Nt MAX4-1基因的组织特异性表达进行了分析,结果表明,Nt MAX4-1在烟草茎中表达量最高,根中次之,叶和花中基本检测不到。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

野生种马铃薯PHYA基因cDNA的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从野生种马铃薯（Solanum pinnatisectum Dun）中克隆到1个光敏色素基因PHYA,其cDNA全长为3466bp,含有一个3 372bp的完整开放阅读框,编码一条长1123个氨基酸的蛋白,分子量为125kDa,等电点为5．8-该基因编码的蛋白序列与栽培种马铃薯、番茄和烟草基因编码的氧基酸序列同源性分别为96％、94％和91％。半定量RT-PCR分析表明,PHYA在根、茎和芽中的表达量较高;光对PHYA表达的作用在地上部器官中表现为抑制,而在地下部器官中则促进。     

烟草NtNAC1基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析

NAC转录因子在植物信号转导及非生物损伤过程中起重要作用。本实验从烟草c DNA文库中克隆了NtNAC1基因,c DNA编码区全长861 bp,编码286个氨基酸。进化树分析结果显示,Nt NAC1基因编码的氨基酸序列与马铃薯同源性最高。农杆菌介导的遗传转化获得37株转基因烟草,用20%PEG6000处理转基因和野生型植株7 d。结果显示,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的酶活性都高于野生型,丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量都低于野生型。RT-PCR分析结果显示,Nt NAC1基因以及Nt NAC基因表达高于野生型,脯氨酸合成的2个关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸-δ-氨基转移酶(δ-OAT)基因表达低于野生型。选取T_0代转基因和野生型种子,对苗期根系进行耐旱性分析。结果发现,在300 mmol·L~(-1)甘露醇胁迫下,转基因根系比野生型长,野生型根系的生长明显受到抑制。这表明转Nt NAC1基因的表达可能提高了植株的抗旱能力。     

烟草肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸-辅酶A基因的

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸-辅酶A(4CL)是烟草苯丙烷代谢途径的关键酶,其多酚类产物与烟草品质密切相关。本研究以酚类物质含量合成差异较大的2个烤烟品种红花大金元(HD)和K326为试验材料,利用同源克隆技术获得这2种烟草Ntc4h和Nt4cl基因的cDNA序列并进行表达特性分析。结果表明,在2个品种中Ntc4h和Nt4cl各有2个同源基因,Ntc4h1、Ntc4h2、Nt4cl1和Nt4cl2的ORF长度分别为1518 bp、1518 bp、1644 bp和1629 bp。Nt4cl1、Ntc4h1和Ntc4h2在编码序列上存在品种间差异。实时荧光定量PCR分析结果表明,该2种酶的基因在烟草中具有明显的时空表达特异性,2种酶基因在根、茎、叶、花和萼片中都有表达,在茎的木质部和韧皮部中的表达量均显著高于其他组织;在圆顶期和适熟期表达水平较高,在适熟期达到最高;且两品种中的表达模式存在差异。     

朝仓花椒几丁质酶类似基因的克隆及分析

根据本实验室已建立的朝仓花椒转录组数据库提供的序列信息设计引物,以朝仓花椒嫩芽为材料提取总m RNA,采用RACE技术克隆了朝仓花椒几丁质酶基因5'端1 080 bp和3'端896 bp c DNA片段,连接至p UC19载体,经测序拼接后获得全长1 373 bp的(Zanthoxylum piperitum DC.var.inerme Makino Chitnase 1,Za CHI 1)c DNA序列,其中开放阅读框969 bp,共编码322个氨基酸残基。在NCBI中BLASTp比对,Za CHIT 1与c克莱门柚、土瓶草CHIT序列同源性分别为88%和81%;预测的蛋白质Za CHIT 1氨基酸序列经BLAST比对,显示该预测蛋白质序列属于lysozyme-like超家族。对Za CHIT 1基因在不同器官中的表达量进行测定后发现,该基因在不同器官中的表达量有明显的差异,在器官中具体表现为在茎中最高,其次是果实,最后是叶片。此外,该基因的表达量与性别无关。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。     

马氏珠母贝STA RDL3基因的克隆与表达性分析

采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝STARDL3基因c DNA全长序列(Pm-STARDL3);利用荧光定量技术检测Pm-STARDL3基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm-STARDL3基因c DNA序列全长3 655 bp,开放阅读框(ORF)长1 491 bp,编码496个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长110 bp,3'UTR长2 054 bp。PmSTARDL3氨基酸序列同源比对分析显示与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)STARDL3的序列的相似度最高。SMART软件分析得出,Pm-STARDL3有STARD类蛋白特有的结构域。荧光定量PCR检测结果表明Pm-STARDL3在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃与闭壳肌,各组织的表达量差异具统计学意义(p0.05)。