抗虫杀菌融合基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的基因(Bacillus thuringiesis,简称Bt)通过甘氨酸接头(Gly4Ser)3与一种人工合成的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)基因与相融合,编码一种新的杀虫,并具有抗菌的蛋白。把融合基因(NAMP-Bt)连接到原核表达载体pET-28a和植物表达载体pBI-121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明含有融合基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功,并将该融合基因转入烟草,已获得抗性小植株。     

家蝇抗菌肽diptericin基因在大肠杆菌中的表达

为了实现原核表达的途径高效获取抗菌肽蛋白,以RT-PCR的方法反转录合成家蝇的抗菌肽diptericin基因,并克隆至p GEX-4T-1载体上,转化至大肠杆菌BL21宿主菌进行表达。测序结果显示,RT-PCR克隆到长345 bp的家蝇diptericin基因,重组菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测到目的蛋白的融合表达,结果表明带有GST标签的融合蛋白大小约为37 k D,并且通过GST纯化柱纯化得到了目的蛋白。     

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。     

抗菌肽CM4与人可溶性B淋巴细胞因子hsBAFF在大肠杆菌中的融合表达

为进一步探讨抗菌肽CM4的原核表达及其生物学功能,本实验研究了抗菌肽CM4与人可溶性B淋巴细胞刺激因子hsBAFF的融合表达及抗菌肽CM4的生物学活性。运用PCR把B淋巴细胞因子hsBAFF和家蚕抗菌肽CM4进行基因融合,构建了融合表达载体pET28a (+)/CM4-hsBAFF,并在大肠杆菌中获得高可溶性表达的融合靶蛋白,且存在于超声破碎后的上清,经分子筛Sephadex G-75纯化后的重组融合蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.SDS-PAGE分析表明：可以通过分子筛一步纯化得到融合蛋白,该重组融合蛋白的分子量约22.0 KDa。Western blot结果显示该重组蛋白能与鼠抗人hsBAFF的抗体发生特异性反应.运用基因工程的方法获得CM4-hsBAFF重组融合蛋白,并具有很好的抑菌生物学活性。     

光滑鳖甲抗菌肽的原核表达条件优化及其抗菌活性

【目的】本研究旨在探索光滑鳖甲Anatolica polita borealis抗菌肽Ap AMP1015的最佳原核表达条件及其抗菌活性。【方法】利用生物信息学方法对得到的Ap AMP1015基因序列和蛋白结构进行分析,运用原核表达技术表达Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,通过Western blot方法鉴定蛋白,并利用亲和层析的方法获得纯化的Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,抑菌圈实验验证蛋白抗菌活性。【结果】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,其开放阅读框长387 bp,编码128个氨基酸,其中包含由19个氨基酸组成的信号肽和75个氨基酸组成的成熟肽。NCBI数据库同源序列比对结果显示该蛋白属Coleoptericin抗菌肽家族。确定了蛋白表达的最佳条件:0.1 mmol/L IPTG 150 r/min 25℃诱导4 h。肠激酶切割后的Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌Escherichia coli的生长。【结论】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,获得了其编码蛋白的最优表达条件,研究发现Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌的生长。本研究为光滑鳖甲抗菌肽Ap AMP1015的应用和进一步研究奠定了基础。     

小麦Fe超氧歧化酶基因的原核表达分析

采用RT-PCR技术分离小麦Fe超氧歧化酶基因(FeSOD)的ORF全长cDNA,然后构建其原核表达载体,并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行优化,以期获得较大量的重组蛋白。结果表明:实验获得了小麦FeSOD基因的ORF全长（600 bp）,ORF全长与原核表达载体pET-Dute1相连接构建了原核表达载体pET-FeSOD,将pET-FeSOD导入宿主菌Rosetta(DE3)中,经SDS-PAGE电泳结果显示,可以高效表达融合蛋白且表达的蛋白均主要以包涵体的形式存在;重组质粒表达出25.8 kD的融合蛋白,除去载体pET-Duet1自身表达的3.0 kD蛋白后,与FeSOD编码的约为22.8 kD蛋白的大小一致;对诱导表达条件的优化结果显示,融合蛋白 pET-FeSOD最佳的诱导表达条件为:0.5 mmol/L的IPTG浓度,37 ℃诱导5 h。该研究结果为进一步深入研究该基因的特性与功能奠定了基础。     

美洲大蠊抗菌肽AMPPA13的表达及纯化

[目的]预测美洲大蠊新的抗菌肽基因,构建原核表达体系并纯化表达产物。[方法]通过生物信息学方法,预测分析出潜在的美洲大蠊抗菌肽。构建pET32a重组质粒,优化诱导表达条件,通过亲和层析,分子筛等手段获得纯化的抗菌肽,并进行Western Blot鉴定。[结果]预测出美洲大蠊新的抗菌肽基因AMPPA13,成功构建重组质粒pET32aAMPPA13。优化诱导表达条件得最佳IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为37℃。纯化后AMPPA13浓度为268μg/m L。[结论]克隆出美洲大蠊抗菌肽基因,并成功构建原核表达体系,得到1 m L纯化的AMPPA13,经Western Blot鉴定,表达产物正确。     

人乳头瘤病毒16型E7密码子优化后的原核表达及免疫原性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因密码子优化后的原核表达系统,通过特异性抗体制备评价E7融合蛋白的免疫原性。方法人工合成优化后的HPV16 E7基因,利用特异引物扩增HPV16 E7基因。将E7基因连接至原核表达载体构建重组表达质粒pMAl-c2X-E7,转化至感受态细胞DE3后,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物E7融合蛋白。纯化后的E7融合蛋白免疫动物,采用ELISA检测动物血清效价。结果 E7基因PCR产物的测序结果与优化后的目的基因序列比对一致。表达的E7融合蛋白经SDS-PAGE分析表明:在相对分子质量50 000处有特异性表达带,与预期相符。以E7融合蛋白制备的多克隆抗体其血清效价可达1∶64 000。结论成功构建的重组表达质粒pMAl-c2X-E7可有效表达MBP-E7融合蛋白,E7融合蛋白具有良好的免疫原性。     

一种新型改良硫氧还蛋白融合表达体系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表达

通过改良硫氧还蛋白融合表达体系,原核表达cathelicidin家族抗菌肽Lf-CATH2。首先在Lf-CATH2基因上游加入凝血酶位点,并去除p ET32α载体的凝血酶序列和S标签序列,构建优化的Lf-CATH2-p ET32α-TS载体,于大肠杆菌中表达。产物融合蛋白经凝血酶切割释放Lf-CATH2,纯化后进行抗菌活性检测。结果表明改良的硫氧还蛋白融合表达体系显著提高酶切效率达37%,Lf-CATH2在新体系中获得了可溶性高表达,且保留了抗菌活性。因此该新型硫氧还蛋白融合表达体系,有望为cathelicidin家族及其他阳离子活性肽提供更好的原核表达载体工具。     

利用融合蛋白EDDIE在大肠杆菌中高效表达抗菌肽Cecropin AD

本研究采用猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)定点突变外壳蛋白(EDDIE)为融合蛋白,对抗菌肽Cecropin AD(CAD)基因进行了高效融合表达,获得了有抗菌活性的抗菌肽CAD。首先采用重叠PCR基因合成技术将编码抗菌肽的CAD基因与猪瘟病毒定点突变外壳蛋白EDDIE编码基因合成为e-cad融合基因,接着将融合基因e-cad采用定点同源重组的方法连接到载体pET30a上,构建成pETED表达载体,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)表达,表达的融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%以上。蛋白质在体外复性,融合蛋白中EDDIE自我剪切,产生抗菌肽CAD。抑菌试验表明抗菌肽CAD能有效地抑制大肠杆菌和藤黄八叠球菌的生长,并且对酵母菌的生长也有微弱地抑制作用。以EDDIE为融合蛋白是在大肠杆菌中高效表达抗菌肽的一种好方法。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism