蜡样芽孢杆菌胶原酶基因colR75E在毕赤酵母中的重组表达

【目的】利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶。【方法】以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶col R75E基因,构建p PICZαA/col R75E重组质粒,将该质粒线性化后电转化至毕赤酵母X-33菌株,诱导其表达并对表达条件进行优化。将表达后的酵母发酵液上清通过硫酸铵沉淀、脱盐处理及亲和层析纯化步骤获得高纯度重组Col R75E胶原酶。利用胶原酶活力测定、SDS-PAGE电泳、胶原酶谱、I型胶原蛋白及不同底物蛋白降解产物电泳等方法对重组胶原酶Col R75E的活性及底物特异性进行分析。【结果】毕赤酵母中最佳表达重组胶原酶Col R75E的条件为p H 6.0,甲醇终浓度为2.5%,诱导时间72 h,诱导后的蛋白经SDS-PAGE、胶原酶谱以及I型胶原蛋白降解产物电泳分析发现,毕赤酵母中表达的重组胶原酶分子量符合预期,蛋白纯度超过95%,具有较好的胶原蛋白水解活性并测得其比活力为4.977 U/mg。该酶对I型胶原蛋白表现出较好的专一性,但是对牛血清白蛋白、酪蛋白及溶菌酶蛋白没有水解活性。【结论】利用毕赤酵母真核表达系统能够获得高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域奠定了理论和方法基础。     

产胶原酶的蜡样芽胞杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化

【目的】优化蜡样芽胞杆菌R75E菌株产胶原酶的条件,并通过蛋白分离纯化技术获得高纯度胶原酶。【方法】利用单因素及正交试验优化蜡样芽胞杆菌R75E产胶原酶的发酵条件及发酵培养基,将发酵液离心除菌后得到粗酶液,对其依次通过硫酸铵分级沉淀、Butyl FF疏水层析及SuperdexTM 200凝胶过滤层析等方法对目标胶原酶进行分离纯化,利用SDS-PAGE电泳检测其纯度。【结果】优化后发酵条件为培养温度41°C、接种量6%、培养时间36 h,优化后发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、起始p H 7.0,粗酶液酶活力较优化前提高了2.9倍;将该粗酶液经过一系列纯化后得到纯度超过90%的胶原酶产物,其纯化倍数和回收率分别为18.4和1.1%。【结论】获得蜡样芽胞杆菌R75E的最佳产酶条件,并对胶原酶分离纯化的方法进行了探索,为微生物胶原酶的开发应用奠定基础。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化简

目的：构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到厅sE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果：构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0．1mmol/LIPTG诱导3h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论：实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

目的:构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到ftsE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果:构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0.1 mmol/L IPTG诱导3 h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论:实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的分离纯化

从堆积骨骼的土样中筛选出高产胶原蛋白酶的MBL13菌株,经鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。对其所产的胶原蛋白酶BCC进行分离纯化,并进行酶学性质的研究。从菌株的发酵液中纯化出分子量约为38.0kDaBCC酶。酶反应的最适温度为40℃,最适pH为8.0。在50℃以下稳定,60℃保温1h酶活仅保留10%;在pH7.0～8.5活性较稳定;金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+对酶有激活作用,金属离子Cu2+对酶有显著的抑制作用。EDTA和EGTA能抑制该酶,表明BCC酶为一种金属蛋白酶。酶的底物特异性表明该酶为骨胶原蛋白酶,且对Ⅰ型骨胶原蛋白水解能力极显著高于Ⅱ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白。将纯化的BCC酶应用于骨胶原蛋白的水解可以得到不同链长的多肽,其水解能力高于标准品胶原酶Ⅰ型。本研究为工业酶提供了新的菌株和新型胶原蛋白酶,为胶原蛋白酶的开发提供了重要的理论依据。     

牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL亚基的原核表达及其生物学活性分析

蜡样芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,分布广泛,具有一定的致病性。不同的蜡样芽孢杆菌携带有不同的毒力因子,这直接决定了蜡样芽孢杆菌株致病性的差异。研究和探讨毒力因子分布以及具体毒素的生物活性有助于对蜡样芽孢杆菌病采取更科学的防控。本研究通过原核表达系统将溶血素BL三亚基重组表达,并对表达蛋白进行了纯化和部分生物学活性的检测。研究结果表明,牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL可以在原核表达系统中成功表达和纯化,牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL拥有溶血性、细胞毒性、很好的免疫原性以及对小鼠具有一定的免疫保护性。本研究表达了溶血素BL三亚基,并探究了牛源致病性蜡样芽孢杆溶血素BL的生物学活性。本研究为进一步揭示蜡样芽孢杆菌溶血素BL的致病作用机制和建立针对牛源致病性蜡样芽孢杆菌病的检测方法奠定了理论基础。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

抗菌肽Cec4a的重组表达和抗菌活性研究*

目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性。方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段。利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白。在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性。结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致。Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL。结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌EA1蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组炭疽芽孢杆菌EA1蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽孢杆菌A16R疫苗株染色体中扩增编码EA1蛋白的eag基因序列,经过纯化、酶切后克隆到含有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-2中,构建重组载体pGEX-EA1;将空载体（作为对照）、重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果：构建了EA1蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化获得了EA1蛋白;Western印迹表明,此蛋白可与GST标签抗体反应。结论：在原核表达系统中表达并纯化得到EA1融合蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

E75A and E75B have opposite effects on the apoptosis/development choice of the Drosophila egg chamber

The number of Drosophila egg chambers is controlled by the nutritional status of the female. There is a developmental checkpoint at stage 8, which is controlled by BR-C in the follicle cells along with ecdysteroid. During this period, developmental decision is made in each egg chamber to determine if it will develop or die. During nutritional shortage, inducing apoptosis in the nurse cells of stages 8 and 9 egg chambers reduces the number of egg chambers. We show that ecdysone response genes E75A and E75B are involved in inducing or suppressing apoptosis. It is thus possible that the E75 isoforms A and B are involved in the decision to develop or die in oogenesis. We have established part of the pathway by which ecdysone response genes control apoptosis of the nurse cells and hence select between degeneration or development of individual egg chambers at stages 8 and 9.     

Identification of a collagenase produced by Bacillus cereus R75E isolated from human colostrum

Applied Biochemistry and Microbiology - Recent studies have shown that the human colostrum and milk are a continuous supply of commensal, mutualistic and/or potentially probiotic bacteria to the...     

Loss of the ecdysteroid-inducible E75A orphan nuclear receptor uncouples molting from metamorphosis in Drosophila

Isoform-specific null mutations were used to define the functions of three orphan members of the nuclear receptor superfamily, E75A, E75B, and E75C, encoded by the E75 early ecdysteroid-inducible gene. E75B mutants are viable and fertile, while E75C mutants die as adults. In contrast, E75A mutants have a reduced ecdysteroid titer during larval development, resulting in developmental delays, developmental arrests, and molting defects. Remarkably, some E75A mutant second instar larvae display a heterochronic phenotype in which they induce genes specific to the third instar and pupariate without undergoing a molt. We propose that ecdysteroid-induced E75A expression defines a feed-forward pathway that amplifies or maintains the ecdysteroid titer during larval development, ensuring proper temporal progression through the life cycle.