拟南芥AtCDPK1基因克隆与转化马铃薯的研究

以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥钙依赖蛋白激酶基因(AtCDPK1)。AtCDPK1基因全长为2 269bp,碱基序列与已知基因At1g18890完全一致。构建AtCDPK1基因的植物表达载体pCHF3-CDPK1,并利用农杆菌介导法将pCHF3-CDPK1转入马铃薯品种‘费乌瑞它’的脱毒试管微型薯中,经筛选与植株再生,共获得50个抗性再生植株。PCR检测显示,有36个植株基因组中含有AtCDPK1基因。RT-PCR分析证实,AtCDPK1基因在这些马铃薯植株的基因组中均能正常转录表达。这一结果为进一步开展AtCDPK1基因功能分析及转基因抗旱马铃薯新品种选育研究奠定了基础。     

拟南芥AHAl基因启动子的表达特性分析

从拟南芥中分离到编码质膜H^＋-ATPase的AHA1基因启动子序列813bp,并构建了此种启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,得到转基因拟南芥。用组织化学方法分析AHA1基因启动子驱动GUS转基因拟南芥的结果表明,GUS基因在转基因的拟南芥根、茎、叶、花和荚的维管组织中均有表达,且不同发育时间内GUS基因表达也不同。以上研究表明拟南芥AHA1基因可能参与植物的生长发育与抗逆胁迫反应。     

海州香薷(Elsholtzia haichowensis Sun)细胞壁转化酶基因启动子(EhcwINVP)的克隆及活性分析

以海州香薷基因组DNA为模板,通过hiTAIL-PCR和walking技术扩增得到其细胞壁转化酶基因启动子(Ehcw INVP)片段,长度为1727 bp。生物信息学分析结果表明,该启动子片段中含有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素以及对干旱、低温、重金属铜等逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。将通过克隆得到的Ehcw INVP序列替换p CAMBIA1301载体上驱动GUS报告基因表达的Ca MV35S启动子序列,构建Ehcw INVP融合GUS的植物表达载体Ehcw INVP::GUS。转基因拟南芥植株的组织化学分析结果表明,海州香薷细胞壁转化酶基因启动子序列具有驱动GUS基因表达的功能,且在10μmol/L铜胁迫下,转基因拟南芥植株叶和根中的GUS活性分别约是对照组的1.7倍和1.5倍。     

拟南芥AtVQ29基因的克隆与植物表达载体构建

目的:VQ模序蛋白是植物中所特有的一类具有高度保守序列的蛋白质,广泛参与植物的生长发育与逆境反应,本研究拟克隆拟南芥的AtVQ29基因并进一步构建由组成型启动子CaMV 35S驱动的植物表达载体pSN1301-AtVQ29。方法:采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,根据已报道的AtVQ29基因序列设计并合成引物,通过PCR技术扩增获得拟南芥AtVQ29基因,经T载体克隆后测序。利用生物信息学软件对序列进行初步分析,同时基于基因重组技术构建植物表达载体。结果:序列分析表明已成功克隆AtVQ29基因,该基因编码区全长为372bp,共编码123个氨基酸残基,具有保守的VQ模序。并进一步构建了由组成型启动子CaMV 35S驱动的AtVQ29基因植物表达载体pSN1301-AtVQ29。结论:本研究所构建的AtVQ29基因植物表达载体能够在转基因植株中过量表达AtVQ29基因,为后期开展基因功能研究与植物基因改良奠定了基础。     

高效删除标记基因的Bhlea2植物表达载体的构建

为培育去除选择标记基因的耐旱转基因植物,同时利用Cre/Lox和FLP/frt系统,构建一个能够高效删除标记基因的Bhlea2基因植物表达载体.拟南芥rd29A启动子是在低温、干旱、高盐胁迫下的快速应答启动子,玉米ubiquitin启动子可有效驱动外源基因的转录,拟南芥pAB5启动子是花粉及胚胎等发育早期特异表达的启动子,利用上述启动子构建了表达Bhlea2基因并能够删除标记基因的植物表达载体.该表达载体包括重组酶表达元件pAB5-FLP、Bhlea2抗旱基因表达元件rd29A-Bhlea2和bar标记基因表达元件ubiquitin-bar.     

结缕草胁迫诱导型启动子Rd29A的克隆及功能鉴定

以结缕草基因组DNA为模板,根据已报道Rd29A启动子序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Rd29A启动子的基因片段,通过序列分析与文献报道的基因序列有41.65％的同源性.在GenBank上的登录号为EU346948.利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG (35S-GFP)和pBIRG (Rd29A-GFP)两个植物表达载体,进而采用基因枪法对洋葱表皮细胞进行遗传转化,检测Rd29A启动子在受体细胞中调控基因表达的活性.结果表明,克隆到的Rd29A启动子活性强于组成型的35S启动子,利用GFP瞬时表达的分析方法有效的筛选到用于进行草坪草抗逆育种的启动子.     

厚藤脱水素基因IpDHN启动子IpDHN-Pro的克隆和调控转录活性分析

为了解厚藤(Ipomoea pes-caprae)脱水素基因IpDHN (GenBank登录号:KX426069)启动子的转录活性和对非生物胁迫和植物激素ABA的响应,通过染色体步移法克隆了IpDHN的上游启动子序列IpDHN-Pro,长度为974 bp。构建IpDHN-Pro调控下GUS转基因载体,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株获得IpDHN-Pro::GUS转基因植株并进行GUS染色,验证IpDHN-Pro启动转录活性以及在氯化钠、甘露醇、ABA处理后拟南芥GUS基因表达变化。结果表明,扩增获得的IpDHN-Pro序列包含多个顺式作用元件,包括1个ABRE、3个Myb转录因子结合位点、富含TC的重复序列以及Skn-1基序等。转基因拟南芥GUS染色及qRT-PCR表明该序列可驱动GUS基因在拟南芥稳定表达,且表达受高盐、渗透压及ABA的诱导。这表明IpDHN-Pro是一个盐旱、ABA诱导的启动子序列,可应用于相关的植物抗逆遗传工程研究。     

拟南芥干旱诱导型启动子RD29A驱动花生AhNCED1基因双元表达载体的构建

从拟南芥基因组中克隆RD29A基因5'-侧翼520bp启动子区域序列,生物信息学分析表明,该启动子片段中存在脱水胁迫响应元件(DRE)、ABA响应元件(ABRE)、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。构建了干旱诱导型启动子AtRD29Ap驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1。     

不同启动子调控转GhCDPK1基因烟草的抗逆性研究

为探究不同启动子对陆地棉GhCDPK1基因抗逆功能的影响,该研究克隆了长度为824bp和1 524bp的2个拟南芥RD29A的启动子序列,分别构建了35S启动子和2个RD29A启动子驱动的GhCDPK1融合表达载体,并利用农杆菌介导法转化烟草,分析了其驱动的转GhCDPK1基因烟草,在逆境胁迫处理后的表型变化,叶绿素、丙二醛(MDA)和脯氨酸含量,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及细胞膜透性的生理变化。结果显示:RD29A启动子驱动的转GhCDPK1基因烟草,比35S启动子驱动表现出更强的耐逆性,其叶绿素含量、脯氨酸含量以及POD、SOD活性都高于35S启动子,而MDA含量与细胞膜的通透性低于35S启动子,且1 524bp的RD29A2启动子片段驱动转GhCDPK1基因烟草的耐胁迫能力比824bp启动子片段更强。     

白桦BpSPL2基因启动子的克隆及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的转录因子,研究表明其在参与发育阶段转变、花和果实发育等方面起着重要作用。利用PCR技术从白桦基因组DNA中扩增获得BpSPL2基因上游1 960 bp启动子序列,使用PLACE和Plant CARE在线软件分析序列,发现BpSPL2基因启动子序列中含有与开花、非生物胁迫及激素响应等相关的顺式作用元件,暗示其在植物的生长发育和胁迫应答中起重要作用。进而构建了BpSPL2基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,并利用农杆菌介导将其瞬时转化至白桦和拟南芥,通过GUS组织化学染色检测BpSPL2基因启动子的组织表达特性,结果表明BpSPL2基因启动子具有启动子活性,能够驱动GUS基因在白桦和拟南芥中表达;而其表达活性在白桦的叶片、芽及根部中较强,在拟南芥的花药、雌蕊和叶片较强,为进一步研究白桦BpSPL2基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

The life and death of gene families

One of the unique insights provided by the growing number of fully sequenced genomes is the pervasiveness of gene duplication and gene loss. Indeed, several metrics now suggest that rates of gene birth and death per gene are only 10–40% lower than nucleotide substitutions per site, and that per nucleotide, the consequent lineage‐specific expansion and contraction of gene families may play at least as large a role in adaptation as changes in orthologous sequences. While gene family evolution is pervasive, it may be especially important in our own evolution since it appears that the “revolving door” of gene duplication and loss has undergone multiple accelerations in the lineage leading to humans. In this paper, we review current understanding of gene family evolution including: methods for inferring copy number change, evidence for adaptive expansion and adaptive contraction of gene families, the origins of new families and deaths of previously established ones, and finally we conclude with a perspective on challenges and promising directions for future research.     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接

利用套叠PCR技术（又称重叠区扩增基因拼接法）对hGM-CSF基因内第28位氨基酸处的糖基化位点进行突变和进行人促性腺激素基因,腺苷酸激酶短肽与胰岛素样生长因子－基因三者之间的拼接,结果表明采用该技术能在体外实行有效的基因重组和定点突变,其成功率为100％,这一技术不需要内切酶消化和连接酶处理,技术操作员简单易行,在基因拼接,基因内部突变方面具有良好的应用价值。     

成簇基因的时空表达调控

成簇基因具有不同单个基因的特性,同一簇内基因大多有类似的结构,功能以及表达模式,基因之间时空表达模式及表达量高度协调,提示同一簇基因是作为统一整体进行调节的,具有共同的调节机制。基因成簇排列是实现基因时空协调表表达的基础,是遗传信息的一种高级组织形式,具有强大的进化优势,要揭示成簇基因表达调控的基本规律,应从顺式作用元件,反式作用因子,染色质等层次,进行整体的以及多基因相互作用的研究,这些机制的阐     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因,ｐｌ６基因为目的基因,将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游,构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６,并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

运动能力相关基因的先天遗传与后天转移

对人体生理特性的研究结果显示,部分运动相关基因如α-肌动蛋白-3、血管紧张素I转换酶、Ⅱ型活化素受体B的基因多态性会明显影响运动员的运动天赋和体能。建立优秀运动员基因库,发现和鉴定可影响运动能力的基因变异体,使得在儿童中开展DNA测试,挑选适合某种特殊体育项目的运动天才和优化训练方法具有一定现实操作意义。另一方面,随着滥用基因技术以提高运动能力的可能性不断提高,部分基因有可能作为基因兴奋剂,通过基因转移的方法导入人体,其所涉及的伦理问题、对人类健康及社会的潜在危害等,已经引起了来自自然科学和社会科学不同领域的广泛关注。     

基因功能研究方法浅介

随着人类基因组计划的进展,数据库中积累了越来越多未知功能的基因序列,分析这些基因的功能将成为基因组计划的主要任务。本介绍了几种研究特定基因功能的方法及程序。     

硫霉素环化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达及基因定位

将含有硫霉素环化酶基因的重组质粒p6BCl2转化变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24,含有p6BCl2的转化子细胞抽提液分别与琉霉素生物合成阻断变株Y,发酵液以及纯化的Y。中间产物经过体外共培养可产生活性物质．化学分析表明与Y,发酵液混合后产生的是硫霉素,与纯化的Y。中间产物混合产生的是一种不稳定的活性物质。说明硫霉素环化酶基因在S.lividans TK24中得到了表达,其产物以Y。中间产物为底物并弥补了Y,中的缺陷。对p6Bcl2中4．5kb外源片段进行了限制酶酶切分析,建立了酶切图谱．利用含硫霉素环化酶基因的S．Lividans TK24转化子体外转化Y,的应用体系,将硫霉素环化酶基因定位在0．9kb Hinc I—Pst I片段上,并证明了硫霉紊环化酶的活性与IPNS同源片段无关。以上实验为进一步研究琉霉素环化酶基因的结构打下了基础。     

植物——病原互作系统中基因对基因识别研究

从自然植物种群对Ｒ基因的选择和淘汰、对属和种的专化性、抗病基因的复杂性、抗病基因的分子专化性、信号传导中基因的相互作用,以及Ｒ基因的开发利用与持久抗性战略等方面总结评述了当前在植物－病原互作系统中基因对基因识别研究领域的新进展,并且提出了需进一步研究的问题。