共表达烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

构建了共表达烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)和丙酮酸羧化酶(PYC)的重组质粒pTrc99a-pncB-pyc,并考察了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-pncB-pyc生产丁二酸的能力。结果表明:重组菌NZN111/pTrc99a-pncB-pyc的NAPRTase和PYC的比酶活达到最高,分别为20.75和1.04 U/mg,同时,辅酶NADH、NAD+及NAD(H)总量达到最高。厌氧摇瓶发酵结果:48 h能够消耗17.5 g/L的葡萄糖生成14.08 g/L的丁二酸,而丙酮酸的产量大幅度降低,仅为0.11 g/L。本研究为基因工程菌大肠杆菌厌氧条件下发酵生产丁二酸提供了一定的基础。     

常压室温等离子体诱变高效利用木糖产丁二酸菌株

大肠杆菌Escherichia coli AFP111是E. coli NZN111 (△pflAB△ldhA) 的ptsG自发突变株,其转化1 mol的木糖合成丁二酸的过程中净产生1.67 mol ATP,但是转化1 mol的木糖合成丁二酸的过程中实际需要2.67 mol ATP,因此在厌氧条件下,ATP的供给不足导致E. coli AFP111不能代谢木糖。采用常压室温等离子体射流诱变产丁二酸大肠杆菌菌株,在厌氧条件下,利用以木糖为碳源的M9培养基,筛选得到一株可以代谢木糖并积累丁二酸的突变株DC111。该突变菌株在发酵培养基中,72 h内可以消耗10.52 g/L木糖产6.46 g/L的丁二酸,丁二酸的得率达到了0.78 mol/mol。而且突变株中伴有ATP产生的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PCK) 途径得到加强,PCK的比酶活相对于出发菌株提高了19.33倍,使得其在厌氧条件下能够有足够的ATP供给来代谢木糖发酵产丁二酸。     

碳源对重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响

研究了在好氧培养基中分别添加不同碳源对两阶段发酵菌体生长、酶活及代谢产物分布的影响,结果表明添加4mmol/L葡萄糖和12,54,80mmol/L乙酸钠均可以提高好氧阶段的菌体密度和相关酶活。将不同条件下培养的菌体转接厌氧发酵后,厌氧阶段的酶活和代谢产物分布也发生改变。进一步对酶活及代谢产物分析表明：Escherichia coli NZN111(sfcA)厌氧发酵过程中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)是产丁二酸的关键酶,丙酮酸激酶(PYK)主要和副产物丙酮酸的积累有关,异柠檬酸裂解酶(ICL)对丁二酸产量也有一定影响。好氧培养基中添加80mmol/L乙酸钠,厌氧发酵结束时丁二酸的质量收率可达89.0%,相比对照提高了16.6%。     

共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和烟酸转磷酸核糖激酶提高重组大肠杆菌发酵木糖产丁二酸

野生型E.coli K12能够在厌氧条件下代谢木糖生长,但是丁二酸不是其主要的代谢终产物。而在E.coli BA203(Δldh A,Δpfl B,Δppc)中,通过过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK),即E.coli BA204,使其能够在厌氧条件下利用木糖发酵生产丁二酸。为了进一步提高生物量及丁二酸的产量,通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)提高NAD(H)的生成,从而提高木糖代谢速率。因此采用2种方法构建了共表达烟酸转磷酸核糖激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的基因工程菌,即E.coli BA208(BA203/p Trc99a-pnc B-pck)和E.coli BA209(BA203/p Trc99a-pck-trc-pnc B)。通过实验发现:厌氧发酵72 h,BA209消耗16.7 g/L木糖,生成15.8 g/L丁二酸,乙酸含量有所降低,而丙酮酸的量几乎不变。BA209中NAD(H)总量和ATP含量较BA208和BA204都有明显的提高。这为考察NAD(H)和ATP 2种辅因子对重组大肠杆菌利用木糖合成丁二酸的影响提供了研究平台。     

发酵产丁二酸过程中废弃细胞的循环利用

对厌氧发酵产丁二酸后的废弃细胞进行破壁处理,考察了以细胞水解液作为有机氮源重新用于丁二酸发酵的可行性。比较了超声破碎、盐溶、酶解3种方法破碎细胞获得的水解液作为氮源发酵产丁二酸的效果,结果表明酶解制得的细胞水解液效果最佳。以总氮含量为1.11g/L的酶解液(相当于10g/L酵母膏)作为氮源发酵,丁二酸产量可达42.0g/L,继续增大酶解液用量对耗糖、产酸能力没有显著提高。将细胞酶解液与5g/L酵母膏联用发酵36h后,丁二酸产量达75.5g/L,且丁二酸生产强度为2.10g/(L·h),比使用10g/L酵母膏时提高了66.7%。因此,厌氧发酵产丁二酸结束后的废弃细胞酶解液可以替代原培养基中50%的酵母膏用于发酵。     

过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的发酵生产丁二酸的潜力菌株。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。nadD为催化NAD(H)合成途径中烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase,NAMNAT)的编码基因,通过过量表达nadD基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+比例。文中构建了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD中NAD+和NADH的浓度分别比宿主菌E.coli NZN111提高了3.21倍和1.67倍,NAD(H)总量提高了2.63倍,NADH/NAD+从0.64降低为0.41,使重组菌株恢复了厌氧条件下生长和代谢葡萄糖的能力。重组菌与对照菌相比,72 h内可以消耗14.0 g/L的葡萄糖产6.23 g/L的丁二酸,丁二酸产量增加了19倍。     

外源添加代谢中间体对产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵制备丁二酸的影响

考察了外源添加中间代谢产物对菌体生长及发酵产酸的影响,结果表明添加0.5g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时丁二酸产量最高。围绕产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵产丁二酸的代谢网络进行代谢通量分析,发现添加PEP后己糖磷酸途径(HMP)与糖酵解途径(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6,解决了丁二酸合成过程中还原力不足的矛盾,导致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%,丁二酸代谢通量从99.8mmol/(gDCW·h)增至124.4mmol/(gDCW·h),而副产物乙酸及甲酸的代谢通量分别降低了22.9%、15.4%;关键酶活分析结果表明,添加0.5g/LPEP后PEP羧化激酶比酶活达到1910U/mg,与对照相比提高了74.7%,而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最终丁二酸浓度为29.1g/L,收率达到76.2%,比未添加PEP时提高了11.0%。     

重组大肠杆菌利用蔗糖及糖蜜发酵生产丁二酸

富含蔗糖的甘蔗糖蜜可作为制备丁二酸的廉价原料。然而生产丁二酸的潜力菌株大肠杆菌Escherichia coli AFP111不能代谢蔗糖。为了使其具有蔗糖代谢能力,将E.coli W中非PTS蔗糖利用系统蔗糖通透酶的编码基因csc B,果糖激酶的编码基因csc K和蔗糖水解酶的编码基因csc A克隆并表达到AFP111中,获得重组菌株AFP111/p MD19T-csc BKA。经厌氧发酵验证,重组菌株72 h消耗20 g/L蔗糖,丁二酸产量达到12 g/L。在3L发酵罐中采用有氧阶段培养菌体、厌氧阶段发酵的两阶段发酵方式,厌氧发酵30 h,重组菌株以蔗糖和糖蜜为碳源丁二酸产量分别为34 g/L和30 g/L。结果表明,通过外源引入非PTS蔗糖利用系统,重组菌株具有较强的代谢蔗糖生长及合成丁二酸的能力,并且能够利用廉价糖蜜发酵制备丁二酸。     

代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺

【背景】Escherichia coli AFP111发酵生产丁二酸时大量副产乙酸,丁二酸得率低。【目的】代谢工程改造EscherichiacoliAFP111,提高丁二酸得率,降低副产物乙酸的生成,建立100 L规模的丁二酸发酵工艺。【方法】一步同源重组敲除乙酸合成途径关键酶基因,改造丁二酸合成途径关键酶启动子实现过表达;单因素优化5L发酵罐培养条件。【结果】敲除乙酸产生途径编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的基因ackA-pta、苏氨酸脱羧酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶的基因tdcDE获得SX02菌株,摇瓶发酵条件下其乙酸产量下降了53.42%,丁二酸得率提高9.85%。在SX02菌株基础上,经启动子改造过表达编码葡萄糖激酶的基因glk后获得菌株SX03,其Glk酶活性提高3.66倍,乙酸产量下降了31.62%,丁二酸得率提高8.28%。SX03菌株发酵生产丁二酸在5 L发酵罐进行放大,其乙酸产量为3.97 g/L,丁二酸得率为1.62 mol/mol葡萄糖,相比出发菌株的乙酸产量下降了75.76%,丁二酸得率提高19.12%。在5L发酵罐上对比研究了中和剂Na2CO3和NaOH混合液替换碱式MgCO3的发酵效果,并优化了发酵pH、搅拌转速和葡萄糖浓度,获得如下最适发酵条件:pH6.8,搅拌转速250r/min,葡萄糖100g/L,发酵结束时乙酸产量为2.24 g/L,丁二酸得率为1.66 mol/mol葡萄糖。中和剂替换优化后乙酸产量下降了20.65%,丁二酸得率提高2.47%。菌株SX03发酵工艺进一步在100 L发酵罐上实现放大,其乙酸产量为1.91 g/L,丁二酸得率为1.30 mol/mol葡萄糖。【结论】通过代谢工程改造的大肠杆菌,其副产物乙酸含量显著下降,丁二酸得率提高,并在5 L和100 L发酵罐上实现了工艺放大,展现出较大的工业化利用潜力。     

过量表达烟酸转磷酸核糖激酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111厌氧发酵的主要产物为丁二酸,是发酵生产丁二酸的潜力菌株。但是由于敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因 (pflB),导致辅酶NADH/NAD+不平衡,厌氧条件下不能利用葡萄糖生长代谢。构建烟酸转磷酸核糖激酶的重组菌Escherichia coli NZN111/pTrc99a-pncB,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加0.5 mmol/L的烟酸、0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的烟酸转磷酸核糖激酶 (Nicotinic acid phosphor