人尿源干细胞的分离与鉴定

为建立高效简便的人尿源干细胞(Human urine-derived stem cells,hUSCs)培养和鉴定体系,在无菌条件下收集青年志愿者的尿液分离培养人尿源干细胞,然后用克隆计数、形态观察、核型分析、生长曲线测定、表面标志物检测、成骨和成脂分化等方法对hUSCs进行鉴定。人尿源干细胞克隆具有纤维样、鹅卵石样和丝连样三种形态。第二代hUSCs高表达抗原CD44、CD73和CD90,阳性率均高于99.6%;而低表达抗原CD34和CD45,阳性率均低于0.3%。第六代hUSCs高表达抗原CD44和CD73,阳性率均高于99.5%;而低表达抗原CD34和CD45,阳性率均低于0.5%。第六代hUSCs仍然具有很强的增殖能力和稳定的核型,并经诱导可分化为骨细胞和脂肪细胞。该研究建立了高效简便的hUSCs培养和鉴定体系。     

雪貂脂肪间充质干细胞的分离、分化与鉴定

目的分离、多向诱导分化并进行鉴定雪貂脂肪间充质干细胞。方法无菌采取雪貂腹部皮下脂肪,机械剪碎为0.5 mm~2,采用含0.075%的胶原酶I消化,应用高糖-DMEM培养基(添加4 ng/mLβ-FGF)培养,观察细胞形态特征,流式细胞术分析细胞表面抗原标志的表达,并检测其体外成脂、成骨、成软骨分化能力,还进一步尝试了诱导神经分化。结果运用组织块贴壁法可以从新鲜脂肪组织中分离到贴壁生长的类似成纤维细胞样细胞,流式分析结果显示高表达CD29(53.1%),CD90(99.6%),CD105(93.7%),低表达CD11b(36.3%),CD45(28.3%)。这些细胞在体外经诱导可以分化成为脂肪、骨、软骨和神经元。结论从雪貂脂肪组织中可以分离得到脂肪间充质干细胞,这些细胞具有多向分化能力。     

糖尿病肾病患者尿源性干细胞的分离鉴定及与健康人尿源性干细胞的细胞生物学比较研究

干细胞移植是糖尿病肾病新的治疗途径,但异种干细胞存在伦理及免疫排斥等问题。该研究从糖尿病肾病患者尿液中提取出一种类似干细胞的细胞,称之为糖尿病病人尿源性干细胞(USCs from patients with diabetic nephropathy,D-USCs),并比较了与健康人尿源性干细胞(urine derived stem cells,USCs)生物学特性的差异。通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,茜素红及油红O染色分别检测成骨和成脂分化潜能,以鉴定其干细胞特性。通过绘制生长曲线比较D-USCs与USCs增殖能力,人促血管生成因子检测试剂盒检测细胞外分泌因子的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率的差异。结果表明,此类细胞可以在体外分离培养,连续传代生长,细胞形态保持米粒状,表达间充质干细胞标志物(包括CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105)、周细胞标志物(CD 146),不表达造血干细胞标志物(包括CD 31、CD 34、CD 45),具有成骨和成脂分化的潜能。与USCs相比,D-USCs的增殖能力受到损伤,分泌因子种类基本保持一致,但数量上有所减少,细胞凋亡率升高。综上所述,该研究成功从糖尿病肾病病人尿液中提取出尿源性干细胞,为干细胞移植治疗肾损害提供了可能的新的细胞来源,避免了异体免疫排斥反应。     

胎膜组织贴壁细胞：一种新的间质干细胞来源

[目的] 建立体外分离纯化胎膜组织贴壁细胞（fetal membrane derived adherent cells,FMDACs）的方法,并且研究FMDACs的基本生物学特性。[方法] 用胰酶消化法分离FMDACs,体外传代培养,并进行向成骨、成脂细胞的诱导分化培养,流式细胞仪、免疫细胞化学检测表面抗原,核型分析及致瘤性实验。[结果] 成功地进行了FMDACs的原代培养及传代培养,FMDACs具有良好的增殖能力,表达CD44、CD29,不表达CD34、CD14、CD45,经诱导后能够分化为成骨细胞和成脂细胞,传代多次后核型正常,无致瘤性。[结论] 胎膜组织中可以分离得到具有间质干细胞特性的贴壁细胞,具有较强的自我更新和多向分化能力,遗传背景稳定无致瘤性。FMDACs为临床应用进行细胞治疗和基因治疗提供了新的来源。     

经血源子宫内膜干细胞培养、鉴定及体外分化潜能的研究

现阶段干细胞的来源常具有侵入性,该文旨在研究新来源于经血的经血源子宫内膜干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs）的基本生物学特性及分化潜能。采用密度梯度法从女性经血中分离MenSCs,测定MenSCs群体倍增时间,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,免疫荧光法检测MenSCs nestin阳性表达情况,体外验证其成骨成脂分化潜能。结果表明,MenSCs具有典型的梭状结构,细胞倍增时间为32.2 h,均一地高表达CD29、CD90及CD105,不表达CD14、CD45、HLA-DR。免疫荧光表明,MenSCs为nestin阳性。MenSCs成脂诱导后,油红O染色为阳性。成骨诱导前期诱导组细胞胶原表达量升高,诱导两周后MenSCs形成钙结节,诱导组细胞ALP（alkaline phosphatase）活性连续3周呈上升趋势。以上证明,MenSCs具有来源广泛的优势,具有较高的增殖能力、较低免疫原性、nestin阳性及多向分化潜能等特性,可成为干细胞治疗的理想种子细胞。     

猫4种不同来源间充质干细胞的生物学特性比较

为比较猫的脂肪、骨髓、羊膜、脐带等器官组织4种不同器官来源间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的生物学特性,本研究通过全血培养法分离培养骨髓来源的间充质干细胞,并采用消化法分离培养脂肪、脐带和胎盘来源的间充质干细胞,比较它们的细胞形态、生长曲线、成脂成骨分化能力以及细胞表面标志物等生物学特性。结果显示,分离得到的4种不同来源的MSC均呈贴壁生长,细胞形态呈梭形、多棱形;均具有成脂成骨分化能力;脂肪源和骨髓源MSC的细胞增殖速度较快,细胞倍增时间较短,而羊膜与脐带源的MSC增殖能力较差,细胞倍增时间较长,4种细胞中脂肪来源MSC的增长活性最好,细胞传至第9代的时候依然保持良好的增殖活性,提示AD-MSC的临床应用可能比较好;4种MSC细胞表面均高表达CD105、CD90和CD44等标志物,低表达CD34。     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的：研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果：纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论：分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的:研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能。方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达。结果:纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力最强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105。成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成。向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达。结论:分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化。     

人脐带和骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性比较

目的体外分离培养、扩增人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)和人骨髓间充质干细胞(h BM-MSC),并对其生物学特性进行比较。方法采用组织块贴壁法从足月胎儿脐带分离、纯化和培养h UC-MSC,健康成人骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和培养h BM-MSC;用倒置显微镜观察两种细胞的形态及细胞生长增殖情况,流式细胞仪分析检测第3代细胞表面标志的表达,Von?Kossa染色及油红O染色检测分化潜能。结果镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一的成纤维细胞样,取相同数量的细胞传代接种后,h UC-MSC的增殖速率快于h BM-MSC,两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45、CD34、HLA-DR、HLA-G、CD80、CD86,两种细胞都有成骨、成脂分化潜能,但h UC-MSC的分化潜能更强。结论 h UC-MSC与h BM-MSC具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力和分化潜能,h UC-MSC有望成为h BMMSC理想的替代来源。     

脐带间充质干细胞——组织工程的新视角

目的 从脐带中分离培养脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) 并进行鉴定,阐明其多向分化的潜在作用.方法 收集健康胎儿脐带,分离培养脐带中的间充质干细胞,以流式细胞仪对培养的间充质干细胞进行细胞表面标志检测,多种成分联合诱导其向脂肪、成骨方向分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化.结果 脐带中分离培养的间充质干细胞不表达造血细胞系的标志CD34、CD45、HLA-DR,强表达CD105、CD44、CD90,在适当的诱导条件下可向脂肪及成骨方向分化.结论 脐带中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞.     

牛脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定

为了给组织工程提供种子细胞,对牛间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)进行体外分离培养。首先应用胶原酶消化法分离牛ADSCs,进行体外培养、连续传代,并观察细胞的形态变化,通过细胞计数绘制生长曲线,细胞压片进行染色体分析,采用细胞免疫荧光化学方法检测细胞表面标记,利用成骨分化和成脂分化检测其分化能力。结果显示牛ADSCs体外培养时细胞形态呈成纤维细胞样,增殖稳定;Vimentin、CD49d、CD13表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性高,茜素红染色呈阳性;成脂诱导条件下细胞周围脂滴明显,油红-O染色呈阳性。结果证明牛ADSCs体外生长稳定、增殖速度快、定向分化能力强,简易的体外分离培养及诱导方法为其在组织工程中的应用奠定了基础。     

儿童原发性肾病综合征患者尿源干细胞分离培养技术研究

该研究探讨建立儿童原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)尿源干细胞(urine-derived stem cells from pediatric patients with PNS,p-USCs)分离培养技术。体外分离培养细胞,进一步观察细胞形态、分析细胞生长曲线及细胞周期、检测细胞表面标志物表达。采用茜素红及油红O染色检测细胞成骨和成脂分化潜能。结果显示,通过离心、贴壁方法从PNS患儿尿液中分离出的细胞,外观米粒样并呈对数生长;细胞表达间充质干细胞表面标志物CD24(cluster of differentiation 24)、CD29、CD73、CD90,但少数细胞表达CD105,周细胞标志物CD146表达阳性,造血干细胞标志物CD34表达阴性;细胞经成骨成脂诱导后,茜素红和油红O染色均呈阳性。以上结果表明,该研究成功建立了PNS患儿p-USCs分离培养的方法,为探讨p-USCs用于儿童PNS早期肾损伤的诊断及难治性肾病的治疗研究提供前期技术方法。     

小型猪ASCs生物学性状研究及其骨组织工程应用探讨

目的:观察小型猪脂肪来源干细胞(adipose derived stem/stromal cells,ASCs)的形态学特点,研究其多向分化潜能和生物学特性,探讨其在骨组织工程方面的应用。方法:切取雄性小型猪背部皮下脂肪,体外分离培养并鉴定ASCs,观察其生长、增殖特性和组织学形态;并诱导其向脂肪细胞和骨细胞多向分化,分别采用油红O染色和茜素红染色鉴定,细胞表面分子通过流式细胞术鉴定。结果:贴壁的ASCs为长梭形,生长增殖快,性状稳定,流式细胞术检测显示CD29、CD90阳性表达,CD14、CD31、CD34阴性表达。通过相应的诱导培养液诱导,ASCs可向脂肪细胞和骨细胞分化并表现出相应的生物学特征。结论:小型猪背部皮下脂肪取材方便,可获得大量脂肪用以分离ASCs,ASCs增殖分化能力较强,在条件培养基诱导下可成骨分化,可作为种子细胞应用于骨组织工程。     

脂肪来源细胞体外增殖规律及定向诱导分化研究

脂肪组织由整形外科吸脂术获得(19例,31．5±5．8岁)。酶消化法分离抽吸物中细胞,体外扩增至第10代．测定细胞生长曲线、累计倍增数目,明确其体外生长规律和增殖能力;通过对表面抗原CD29、CD105、CD106、CD166、CD49d、CD34、CD31、3G5等的检测分析脂肪来源细胞的群体组成：分别向软骨、骨、脂肪定向诱导,进一步明确该细胞群体定向分化能力。实验表明,每300ml脂肪抽吸物平均可获得5×10~7个有核细胞,体外扩增10代,平均每代倍增数目为1．59±0．224．累计倍增数目为15．53。流式细胞学及免疫细胞化学检测显示,干细胞相关抗原CD29、CD105、CD106、CD166等表达率均＞60%,但与造血系相关的CD34、CD31表达率也分别达到7．3%、29．2%。ADC向软骨诱导可检测到Ⅱ型胶原表达;向成骨诱导可见矿化结节形成,并可检测到AKP、Osteonectin基因表达;向脂肪诱导可检测到PPARr2、GLU-4、Leptin基因表达,细胞内有脂滴形成。脂肪来源的细胞获得量大,体外增殖能力强,并含有具有多向分化潜能细胞,有可能作为组织构建的种子细胞。     

人尿源性干细胞及人脐带间充质干细胞的生物学性状比较

该研究探讨人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)及人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的生物学性状差异。分离培养hUSCs及hUC-MSCs,显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测干细胞表面标记物,锥虫蓝拒染实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色、油红O染色及阿利新蓝染色评估多向分化潜能。hUSCs为米粒状贴壁生长细胞,hUC-MSCs为长梭形贴壁细胞,呈旋涡状排列生长,两种细胞表型分析相似,均表达多种间充质干细胞标志物,但CD24在hUC-MSCs表达阳性,而CD105在hUSCs表达阳性。hUC-MSCs的增殖及迁移能力优于hUSCs,但后者的克隆形成能力更强。hUSCs及hUCMSCs都具有成骨、成脂、成软骨分化能力,hUC-MSCs的成骨能力强而hUSCs的成脂能力强。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的hUSCs,该细胞与hUC-MSCs相比具有相似的生物学性状,可作为再生医学自体移植的理想种子细胞来源。     

隔离器内残留过氧化氢去污剂对MSCs和NK两种细胞增殖及生物学特性的影响研究

该文研究了特定过氧化氢去污剂残留量对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的增殖及生物学特性的影响。采用低浓度过氧化氢去污剂建立特定残留量进行MSCs和NK细胞培养,应用细胞计数法分析细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞表面标记,并采用诱导分化培养基定向诱导MSCs成骨、成脂、成软骨分化。结果显示,MSCs和NK细胞在3～5 mg/m³浓度的过氧化氢环境下形态正常且增殖活跃。流式细胞仪检测结果显示,MSCs的CD73、CD105、CD90均呈高表达,CD45、CD34、CD14、CD79a、HLA-DR为阴性表达;NK细胞表达CD56⁺和CD3~–的百分比超过70%。诱导后,MSCs具有成骨、成脂、成软骨分化的潜能。总之,MSCs和NK细胞在含有低浓度的残留过氧化氢去污剂的培养环境中生长良好,与未含有过氧化氢去污剂的培养环境比较,增殖能力和分化潜能均无显著差异。     

比较两种不同来源间充质干细胞的生物学特性及多向分化潜能

该文旨在比较人脂肪间充质干细胞(hADSCs)和脐带间充质干细胞(hUMSCs)的生物学特性,并鉴定其多向分化潜能。体外扩增培养hADSCs和hUMSCs,绘制细胞生长曲线并计算群体倍增时间,通过细胞集落实验比较两种细胞的增殖能力,流式细胞仪和RT-PCR方法分别检测细胞表面抗原和多能性相关基因的表达,采用成脂、成骨诱导分化试剂盒比较两种细胞的分化潜能。hADSCs和hUMSCs表达CD34、CD44、CD45、CD105的比例分别为2.7% vs 6.2%、92.3% vs 93.4%、1.3% vs 3.1%、99.4% vs 98.0%,均表达Oct4和Nanog基因;生长曲线均呈"S"型,两种细胞的群体倍增时间差异不显著(P0.05);随着代数的增加,两种细胞的增殖能力均变弱,但P7的hADSCs的增殖能力要显著优于hUMSCs(P0.05);经油红O、茜素红染色及RT-PCR和细胞免疫荧光方法检测特异基因的表达,表明两种细胞均具备成脂、成骨分化的能力,hADSCs的成脂能力优于hUMSCs,但两种间充质干细胞的成骨分化能力没有显著性差异。hADSCs和hUMSCs具有相似的生物学特性,但hADSCs可能具备更强的增殖能力和成脂分化潜能。     

尿源性干细胞移植修复慢性肝损伤裸鼠肝脏功能

该研究探讨尿源性干细胞(urine-derived stem cells, USCs)的生物学性状及移植治疗慢性肝损失模型的可能。分离培养USCs,观察细胞形态、流式细胞术检测干细胞表面标记,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色、茜素红染色、油红O染色、ICG(indocyanine green)摄取实验、PAS(periodic acid-Schiff)染色等评估其成骨、成脂和成肝分化。建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)诱导的慢性肝损伤模型,尾静脉4次移植USCs,计算肝脏指数,检测血清ALT、AST, HE及Masson染色,评估治疗效果。结果表明, USCs为米粒状贴壁生长细胞,表达多种间充质干细胞标志物:CD24、CD29、CD73、CD90和CD105,表达细胞周期表面标志物CD146,不表达造血细胞表面标志物CD31、CD34、CD45。成骨成肝诱导的USCs后ALP染色、茜素红染色、油红O染色阳性,单纯成肝诱导后几乎无ICG摄取及PAS染色阳性的细胞,而与肝干细胞共培养的USCs诱导组中,约10%细胞有ICG摄取及PAS染色阳性。与模型组相比, USCs移植组肝脏指数显著降低, ALT、AST降低但无统计学意义,肝细胞退行性变及纤维增生明显改善。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的USCs,移植入慢性肝损伤裸鼠,可在一定程度上修复肝脏损伤。     

激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞体外增殖分化能力的研究

通过对激素性股骨头坏死患者股骨头部骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨、成脂分化能力的研究,探讨激素性股骨头坏死的发病机理及自体BMSCs移植治疗股骨头坏死的可行性。选择激素性股骨头坏死患者10例,无股骨头坏死的股骨颈骨折患者10例作为对照组。两组患者在行全髋关节置换术中抽取股骨头部骨髓血,密度梯度离心法分离BMSCs并培养至第3代细胞,流式细胞仪检测细胞特异性表面抗原,成纤维细胞–集落形成实验以及成骨、成脂诱导培养后分析细胞的增殖及成骨、成脂分化能力。结果显示,股骨头坏死组细胞表达BMSCs特异性表面抗原CD44、CD73;股骨头坏死组BMSCs形成集落数明显低于对照组;股骨头坏死组碱性磷酸酶活性和钙结节数均低于对照组;股骨头坏死组的成脂细胞数明显高于对照组。该研究结果表明,激素性股骨头坏死患者股骨头BMSCs的增殖及成骨分化能力下降,但其成脂分化潜能增强,推测BMSCs增殖及分化能力的改变可能参与激素性股骨头坏死病理生理过程。     

人脐带间充质干细胞对肿瘤细胞生长及软琼脂克隆形成的影响

目的研究人脐带间充质干细胞(h UCMSC)体外共培养对肿瘤细胞增殖的影响以及在软琼脂中形成克隆的可能性,从而评价其体外促瘤性和致瘤性,为其体内致瘤性研究及临床应用提供安全性数据。方法剥取脐带华通氏胶,剪碎,组织块贴壁法获得贴壁细胞,培养传代,倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表型,检测诱导成脂肪和成骨及成软骨分化的能力,鉴定是否为h UCMSC。然后,通过体外软琼脂克隆形成实验观察h UCMSC形成集落的能力;h UCMSC分别与人白血病细胞株K562和人结肠癌细胞株Colo-205体外共培养,MTT法测定细胞增殖,并以肿瘤细胞的增殖指数(PI)值来判定h UCMSC是否对肿瘤细胞体外增殖有影响。结果人脐带华通氏胶分离培养的细胞具有成纤维细胞样的细胞形态,具有向成脂肪和成骨及成软骨方向分化的能力,表达间充质干细胞指标CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD45、CD19,符合间充质干细胞特点。软琼脂克隆形成实验显示h UCMSC未表现出在阻力介质中的克隆生长能力。h UCMSC分别与人白血病细胞K562和人结肠癌Colo-205细胞共培养,PI值显示h UCMSC对肿瘤细胞增殖没有影响。结论 h UCMSC体外培养不具有致瘤性,同时对肿瘤细胞增殖无影响。