优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５′端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ′的５′端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用ＰＣＲ法在ＳＤ顺序两侧,即ＳＤ上游６个碱基和ＳＤ与ＡＵＧ之间７个碱基,进行随机突变,它们与结构基因５′端序列形成各种可能的翻译起始区（ＴＩＲ）二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）,５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′ｍＲＮＡ可通过诱导表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在Ｘ－ｇａｌ板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到２６９个５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′融合质粒。从中选择８个不同蓝色的重组子进行β－ｇａｌ活性测定,结果表明它们的酶活性相差在２０倍以上。而ＲＮＡ点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。     

LDL受体基因cDNA的RT－PCR分离、克隆及其在RFLP中的应用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ,将长为２６０５ｂｐ的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＪＮ６,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第７５４位Ｃ→Ｔ,和１６５４位的Ｇ→Ａ,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用ＬＤＬ受体基因ｃＤＮＡ中的ＣｌａⅠ片段作为探针,检测到ＬＤＬ受体基因上外显子８的ＳｔｕⅠ位点是个限制性片段长度多态性位点。所克隆的ｃＤＮＡ含有可译框架的全部密码,因此可作为基因表达材料。     

蛇毒蛋白Echistatin的C端突变基因的构建，表达及其活性研究

通过ＰＣＲ定点突变的技术,将蛇毒蛋白Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ基因的Ｃ端进行了突变（Ａｌａ４８→Ａｒｇ４８→,Ｔｈｒ４９→Ｖａｌ４９）,模拟纤维蛋白Ｎ端的四肽（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ）,以期增加Ｅｃｓ（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）的活性。突变的基因重组到表达质粒ｐＪＣ２６４上,经ＩＰＴＧ诱导,以ＣｈｅＹ－Ｅｃｓ融合蛋白方式进行了表达,表达量占菌体总蛋白的１５～２０％。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５初步纯化该融合蛋白,然后用ＣＮＢｒ裂解,透析,冻干,反相ＨＰＬＣ纯化Ｃ端突变体Ｅｃｓ蛇毒蛋白,Ｎ端十个氨基酸分析与天然的相符,在ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈｐｌａｓｍａ）测活体系中,１０μｍｏｌ／Ｌ的ＡＤＰ诱导,Ｃ端突变体Ｅｃｓ抑制血小板凝聚的活性约为野生型４倍。得到了Ｅｃｓ的Ｃ端突变后使Ｅｃｓ抑制血小板凝聚的活性提高的结果。     

PAK株与PA103株绿脓杆菌外毒素结构基因间的差异及其对功能的影响

对ＰＡＫ株的绿脓杆菌外毒素结构基因进行全长核苷酸顺序测定时发现：来源于ＰＡ１０３株和ＰＡＫ株的ＰＥ基因一级结构间存在差异,其中Ｔｈｒ~（１７９）（ＡＣＣ）→Ａｌａ~（１７９）（ＧＣＣ）、Ｓｅｒ~（５１５）（ＡＧＣ）→Ｇｌｙ~（５１５）（ＧＧＣ）,并有１１个同义突变,但变异并不影响白细胞介素２－绿脓杆菌外毒素融合蛋白的ＡＤＰ－核糖基化活性及其细胞毒活性。     

黑子南瓜甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

依据国外报道的南瓜甘油－３－磷酸转酰酶（ＧＰＡＴ）基因的ｃＤＮＡ序列合成相应引物,用ＲＴ－ＰＣＲ技术,成功地分离了黑子南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｆｉｃｉｆｏｌｉａ）ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段,并亚克隆到了ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统的多克隆位点上,序列分析表明黑子南瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ序列及递推的氨基酸序列与南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍｏｓｃｈａｔａ）相比分别具有９８％和９６５％的同源性。在１１８８ｂｐ中有２２个核苷酸发生变化,导致１３个氨基酸的改变     

苏云金芽胞杆菌cry1A启动子上游区缺失体的研究

利用ＰＣＲ方法，设计相应的扩增引物，以ｐＨＴ／２７２ｕｐ－ｐＳＧＮＵ质粒ＤＮＡ为模板，扩增得到缺失相应序列的上游片段，然后将其连接到ｐＨＴ－ｐＳＧＭＵ穿梭载体的ＢｒＩ－ｌａｃＺ融合基因表达的影响。结果表明，缺失反向重复区，保留弯曲区（ＰＣＲＡ），对ＢｔＩ－ｌａｃＺ融合基因在库斯塔克亚种菌株８０－２１中的表达与完整上游区的增强作用相一致，而在鲇泽亚种中，ＢｔＩ－ｌａｃＺ基因表达量明显比未缺失体低。这     

pINC－lacZ逆转录病毒载体的构建及其在小鼠胚胎干细胞中的表达

小鼠胚胎干细胞系（ＥＳ）是从囊胚的内细胞团中建立起来的多潜能胚胎干细胞系。ＥＳ细胞系目前正广泛用于将基因打靶后的突变和其它遗传变化导入小鼠的种系中。其中,嵌合鼠的获得是非常必要的一步。这就需要用一个可以广泛表达的基因对ＥＳ细胞进行标记。大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的表达在细胞水平就能很容易地观察到,而且对哺乳动物细胞没有任何毒害作用,因而是一个被广泛地用于各种细胞基因表达研究中的报导基因。猿类巨细胞病毒早期（ＳｉＣＭＶＩＥ）启动子是一个广泛用于转基因小鼠研究中的强启动子。然而,该启动子在ＥＳ细胞方面应用的报道尚未见到。本研究用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,从ｐｓｖ－β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ中得到３．７Ｋｂ的ｌａｃＺ基因片断,将其插入到ｐＩＮＣ载体上（Ｆｉｇ．１）,得到ｐＩＮＣ－ｌａｃＺ（Ｆｉｇ．２）。用ＮｏｔⅠ线性化ｐＩＮＣ－ｌａｃＺ后,电击导入ＭＥＳＰＵ－１３细胞中。ＭＥＳＰＵ－１３为本实验室从１２９／Ｔｅｒ品系小鼠的囊胚中建立的一个ＥＳ细胞系。转化细胞在含有２５０μｇ／ｍｌＧ４１８的培养基上培养两周,进行ＭＥＳＰＵ－１３细胞稳定转化子的筛选。在一次转化实验中,从１ｘ１０７个转化的ＭＥＳ     

酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

信号肽C—端和成熟蛋白N—端氨基酸序列的变化时α—淀粉酶分泌作用的影响

本文利用ｐＡｍｙ４１３质粒通过定点诱变技术,在α－淀粉酶基因的２８７和２９１位分别引入１个Ｇ和Ｃ,代替原来的Ｔ和Ｇ,构建成质粒ｐＡｍｙ４１３Ｂ,使成熟的α－淀粉酶Ｎ－端（７）Ｌｅｕ（８）Ｍｅｔ变为（７）Ａｒｇ（８）Ｉｌｅ。ｐＡｍｙ４１３Ｌα－淀粉酶信号序列因引入１个多酶切点接头而比ｐＡｍｙ４１３的２９个氨基酸增加了１３个氨基酸,创造了１个新的信号肽酶Ｉ识别窗口Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｌａ↓Ｓｅｒ,利用计算机对该信号肽进行了二级结构分析。这两株突变株产酶能力分别为野生株（ｐＡｍｙ４１３）的３％和３６％;胞外α－淀粉酶的分子量同于野生株;末端分析显示,成熟酶第一个氨基酸为Ａｌａ,表明信号肽酶Ｉ在野生型识别窗口Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ↓Ａｌａ处切割。结果还表明,Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶在Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中分泌作用属共翻译转移模型     

光合细菌Rhodobacter sphaeroides glnB—lacZ融合子的构建

亚克隆了Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓｇｌｎＢ启动子,以ｐＭＰ２２０为载体构建成ｂｌｎＢ－ｌａｃＺ融合子。将ｇｌｎＢ－ｌａｃＺ、ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ、ｎｉｆＡ＝ｌａｃＺ分别导入Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ谷氨酸合酶突变株ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响,试验证明,在ｇｌｔＢＤ突变株中ｎｉｆＨ的表达受阻遏,ｎｉｆＡ表达水平很低。这证明ｇｌｔ基因的突变引     

以粘粒为基础产生重组单纯疱疹病毒HSV1-lacZ的研究

将总长度为１５２ｋｂ的单纯疱疹病毒１型（ＨＳＶ－１）（１７株）基因组分成５个相互间有部分重叠的大片段（约３５－４０ｋｂ）,分别克隆到粘粒ＳｕｐｅｒＣｏｓＭＷ中,依次称为ｃｏｓ４８、ｃｏｓ２８、ｃｏｓ６、ｃｏｓ１４和ｃｏｓ５６（ＤａｖｉｓｏｎＡＪｅｔａｌ,１９９３）。此５个粘粒用ＰａｃⅠ切去粘粒骨架后共转染细胞,可发生同源重组而产生野生型ＨＳＶ－１。以此为基础,利用粘粒ｃｏｓ５６的ＨＳＶ－１ＵＬ４４基因中含有一个ＸｂａⅠ单一酶切位点的特点,将一个两端加有ＸｂａⅠ位点的ＣＭＶ－ｌａｃＺ－ｐｏｌｙＡ片段插入其中,构建成ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ。将ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ与其它４个粘粒经ＰａｃⅠ酶切后,用ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ转染试剂共转染ＢＨＫ－２１细胞,３７℃培养２－３天,开始出现细胞病变及噬斑。５天后将病变细胞连同培养液一起冻融３次,取上清０．１ｍｌ感染新鲜的ＢＨＫ－２１细胞,３７℃培养２４小时,用Ｘ－ｇａｌ染色３０－６０分钟,镜下观察可见大量蓝色噬斑。蓝色噬斑数占噬斑总数的５０％以上。经空斑纯化的蓝斑病毒可稳定传代。这种方法同将外源基因表达盒插入ＨＳＶｔｋ基因中构建成重组质粒,再与ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ共转染细     

LDL受体基因cDNA的RT—PCR分离,克隆及其在RFLP中的应用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ,将长为２６０５ｂｐ的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＪＮ６,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第７５４位Ｃ→Ｔ,和１６５４位的Ｇ→Ａ,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用ＬＤＬ受体基因ｃＤＮＡ中的ＣｌａＩ片段的作为探针,检测到ＬＤＬ受体基因上外显子８的ＳｔｕＩ位点是个限制性片段长度多态性位点,所克隆的ｃＤＮＡ含有可译框架的全     

蛇毒蛋白Echistatin的C端突变基因的构建,表达及其活性研究

通过ＰＣＲ定点突变的技术,将蛇毒蛋白Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ基因的Ｃ端进行了突变（Ａｌａ４８→Ａｒｇ４８→,Ｔｈｒ４９→Ｖａｌ４９）,模拟纤维蛋白Ｎ端的四肽（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｖａｌ）,以期增加Ｅｃｓ（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）的活性,突变的基因重组到表达质粒ｐＪＣ２６４上,经ＩＰＴＧ诱导,以ＣｈｅＹ－Ｅｃｓ融合蛋白方式进行了表达,表达量占菌体总蛋白的１５￣２０％,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５初步纯化     

王不留行环肽研究

从中药王不留行（Ｖａｃａｒｉａｓｅｇｅｔａｌｉｓ）种子中分离并鉴定了４个环肽化合物,分别命名为王不留行环肽Ａ,Ｂ,Ｃ,Ｄ（ｖａｃｃａｒｉｎｓＡ,Ｂ,Ｃ,Ｄ）,其中王不留行环肽Ａ为新环肽化合物。其结构通过光谱和化学方法分别确定为：ｖａｃｃａｒｉｎＡ——ｃｙｃｌｏ－（Ｔｒｐ－Ａｌａ１－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ａｌａ２）,ｖａｃｃａｒｉｎＢ———ｃｙｃｌｏ－（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ１－Ａｌａ－Ｐｈｅ２）,ｖａｃｃａｒｉｎＣ———ｃｙｃｌｏ－（Ｐｒｏ１－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ２－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ）,ｖａｃａｒｉｎＤ———ｃｙｃｌｏ－（Ｐｒｏ－Ｖａｌ１－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ２）．     

金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ）,其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用ＰＣＲ 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外,将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９,获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．     

黄淮麦区16个小麦品种（系）的Glu—1,Glu—3和Gli—1位点上的基因多样 …

１６个品种（系）的高分子量麦谷蛋白亚基（ＨＭＷ－ＧＳ）的等位基因频率分别为Ｇｌｕ－Ａｌａ（８０％）,Ｇｌｕ－Ａｌｃ（１２％）,Ｇｌｕ－Ａｌｂ（８％）;Ｇｌｕ－Ｂ１ｂ（６３％）Ｇｌｕ－Ｂｌｃ（３１％）Ｇｌｕ－Ｂｌｅ（６％）Ｇｌｕ－Ｄｌａ（３８％）,Ｇｌｕ－Ｄｌｄ（５０％）Ｇｌｕ－Ｄｌｃ（１２％）,１６个品种（系）的低分子量麦谷蛋白亚基（ＬＭＷ－ＧＳ）的等位基因频率分别为：Ｇｌｕ－Ａ３ａ（３８％）,Ｇ     

核酶对bcl－2mRNA的体外切割

通过微机对ｂｃｌ－２ＲＮＡ二级结构的分析,设计针对ｂｃｌ－２片段５＇ＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＵＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＵＣＧ３＇的“锤头状”（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ,ＲＤ）基因,平端连接于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）ＨｉｎｃⅡ位点,克隆后经测序表明序列正确,ｂｃｌ－２和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因经体外转录,５０℃作用２ｈ,从１６５６－１６５７（Ｃ－Ｇ）位之间切断ｂｃｌ－２ＲＮＡ片段．     

提高SCA2编码区CAG三核苷酸重复的PCR扩增效率

以遗传性脊髓小脑共济失调Ⅱ型基因（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ ｔｙｐｅⅡｇｅｎｅＳＣＡ２）编码区内的ＣＡＧ三核苷酸重复为研究对象（Ｇ＋Ｃ含量为６９．２％）,比较了热启动ＰＣＲ、碱基替代ＰＣＲ、添加增效剂（１％－１２．５％二甲亚砜、１％－２５％甘油、１％－１２．５％甲酰胺）与常规ＰＣＲ的扩增效率,发现热启动ＰＣＲ、碱基替代ＰＣＲ及添加增效剂（１％－１０％二甲亚砜、５％－２０％甘油、     

人T细胞白血病病霉Ⅰ型env基因的克隆与表达

本文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从整合有人Ｔ细胞白血病病毒Ⅰ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）的ＭＴ－２细胞株中,扩增出ＨＴＬＶ－Ｉ外膜蛋白（ｅｎｖ）的全基因（１．４５ｋｂ）,并成功地克隆入ｐＵＣ１９载体,构建成ｅｎｖ基因克隆ｅｎｖ／ｐＵＣ１９．利用原核高效表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,在大肠杆菌中有效地表达了与谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合的ｅｎｖ羧基末端抗原的重组蛋白,融合基因的转录由ｔａｃ启动子调控。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明,有一约５２ｋＤ的目的蛋白带,表达量占菌体总蛋白的１０％;ＷｅｓｔｅｒＮｂｌｏｔｔ及ＥＬＩＳＡ结果显示,表达产物能与ＨＴＬＶ－Ｉ多抗血清结合。本研究为研制ＨＴＬＶ－Ｉ的诊断试剂及进一步了解ｅｎｖ的免疫学和生物学性质打下了基础。     

异源nifA^C对根癌土壤杆菌nif基因表达的调节作用

用三亲水交配方法分别将载有褐球固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）呈组成型表达的ｎｉｆＡＣ的质粒ｐＣＫ５和肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）含有ｎｉｆＡ＾Ｃ和ｎｉｆＡ－ｎｔｒＣ基因的质粒ｐＣＫ３,ｐＳＺ３６和ｐＳＺ２３－ＣＡ导入根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｎｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８／ｐＧＶ３８５０所得转移接合子的生长速率和野生型相似。在１０ｍ