荧光探针研究新进展

自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(heterogeneousassay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneousassay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。     

核酸荧光探针新进展

核酸荧光探针新进展田少敏阮康成（中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）关键词核酸荧光探针核酸荧光探针作为核酸标记的工具,具有方便、快速、灵敏和安全等特点,近年来得到很大发展,不但种类明显增加,性质上也有进一步改善。下面就笔者得到的最新资料,...     

分子信标及其应用研究进展

分子信标作为一种核酸荧光探针,其最初的设计目的是用来检测核酸,特别是用作实时荧光PCR反应的探针。由于其特殊的发夹结构,决定的其具有多种的用途。不仅能在液相或固相对核酸进行定性、定量分析,还能用于多种DNA－蛋白质、DNA－DNA损伤试剂之间相互作用等的研究。     

核酸测定中的有机荧光探针

对历来利用荧光分析技术研究和定量测定核酸的情况加以简单的综合评述。介绍了截至目前用于核酸研究和测定的一些主要有机荧光试剂,并对新兴的如有机纳米探针和分子信标等荧光分析技术以及有机荧光试剂的发展前景进行评述。     

分子灯标:用于基因检测的荧光杂交探针

随着基因工程技术应用的日趋广泛,如何快速简便准确地检测出基因序列变得日益重要。目前,一种新型的基因检测探针——分子灯标（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ）诞生了。它是在ＤＮＡ杂交技术和荧光共振能量转移原理的基础上开发出来的［１］,可以实现对基因序列的精...     

分子信标探针用于PCR检测对虾白斑杆状病毒

将对虾白斑杆状病毒的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该病毒的PCR检测.温度与荧光强度之间的关系表明,所设计探针的发夹既可以形成也可以打开,符合PCR对分子信标探针的要求.结果表明,在PCR同时加入分子信标探针不影响PCR扩增,分子信标探针只能与目的DNA杂交,具有较高的特异性.随着PCR循环数的增加以及含目的DNA的质粒拷贝数的增加,荧光强度都随之增强.     

生物素标记核酸探针的分子杂交技术及其应用

核酸分子杂交是基于核酸链间互补碱基对的特异性结合,测定核酸碱基顺序同源性的一种现代技术,是基因工程、分子遗传及医学诊断中常用的方法。该法较常规诊断法灵敏度高、特异性强,目前,已广泛应用于重组DNA的筛选、基因分祈、染色体基因定位及病毒病诊断等方面。     

细胞钙离子荧光探针研究进展

钙离子(Ca²⁺)广泛参与细胞生理病理反应,其含量和在胞内位置的改变可激发不同效应。因此,快速有效检测胞内Ca²⁺浓度及其分布对于了解其在细胞活动中的作用具有重要意义。荧光探针法由于灵敏度高、使用方便、成本低廉等优点得到广泛应用,但不同类型的探针在准确性、灵敏度和稳定性等方面各有优劣。本文系统总结了现有的Ca²⁺化学荧光探针和基因编码探针,为开展Ca²⁺相关研究时合理选择检测方法提供参考。     

艾滋病毒核酸探针的制备

 采用PXY104(含化学合成的HIV-env26肽基因4重串联体结构)为材料。温和裂解法提取质粒DNA,制备电泳纯化,Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶解,低融点琼脂糖凝胶电泳回收HIV-DNA片段作为核酸探针;用[α-~(32)P]dATP通过缺口移位法标记,比放射性为4.05—6.69×10~7cpm/μgDNA通过分子杂交能测出lPg的靶DNA,初步试验结果表明,在本文试验条件下,可用该探针检测与之互补的核酸分子。     

复合探针荧光定量PCR法检测布鲁氏菌的实验研究

目的：建立用复合探针荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法。方法：研究根据BSCP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法。用于布鲁氏菌病的筛选和诊断。结果：结果表明该检测方法的特异性为100％,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×10^1-1×10^6拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×10^2CFU／ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5％。结论：本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的方法,可对布鲁氏病原菌进行快速检测,对布病的筛选和确诊具有重要意义。     

复合探针荧光定量PCR法检测布鲁氏菌的实验研究

目的:建立用复合探针荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法。方法:研究根据BSCP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法,用于布鲁氏菌病的筛选和诊断。结果:结果表明该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101-1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102CFU/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5%。结论:本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的方法,可对布鲁氏病原菌进行快速检测,对布病的筛选和确诊具有重要意义。     

复合探针荧光定量PCR方法的建立

为了对特定基因进行实时检测,根据荧光能量转移(FRET)原理,设计及合成了一种新的FRET复合探针,该探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成,其中荧光探针5′端接一荧光素分子,3′端接一延伸阻断分子磷酸,淬灭探针3′端连接一个淬灭分子对甲基红,淬灭探针与荧光探针5′端互补,无模板时,该探针杂交形成复合探针。无荧光产生,当有模板时,荧光探针与模板杂交,荧光不能被淬灭,产生的荧光与模板量成正比。根据复合探针的反应原理,研究了该探针的FRET性质及影响因素包括淬灭探针及扩增片段长度、荧光探针与淬灭探针的合适比例及镁离子浓度。实验结果显示淬灭探针及扩增片段长度对复合探针的作用有明显的影响,本实验采用淬灭探针长21个核苷酸,扩增片段长127bp,荧光探针与淬灭探针的合适比例为1：1,镁离子浓度为3mmo1／L,可获得最佳的反应体系;该复合探针合成简单,淬灭彻底,具有良好的准确性与特异性,敏感性达10^2拷贝,并具有较宽的动力学定量范围,可对10^2—10^9拷贝范围内的待检样品进行准确的定量。复合探针技术可应用于病毒感染水平、转基因拷贝数及单核苷酸多态性等检测。     

活细胞的分子探针——绿色荧光蛋白

来自水母的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）,在不加外源物质的情况下,紫外光激发后,能在原核和玩具核活细胞中发绿色荧光,荧光性质稳定,突变蛋白发光效率提高,激发和发射光谱明显改变。ＧＦＰ是一种十分有用的活细胞分子探针,在基因表达调控,转基因动物研究,蛋白在细胞中功能定位,迁移变化,病原菌侵入活细胞的分子过程等诸多方面均有广泛的用途。     

Digoxigenin标记核酸探针分子杂交技术探讨

Dig标记和检测试剂盒中的封阻试剂配制成0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%六种浓度,65～68℃温度时,溶解时间分别为10、15、20、35、40、45分钟;预杂交,在免疫测定中进行封阻,背景反应最小,其次是不预杂交,在免疫测定中进行封阻,再次是预杂交,在免疫测定中不封阻;标记探针保存在-20℃,至少可稳定18个月,同一探针重复使用三次可获得满意效果.以上结果表明,DigDNA标记和检测系统将代替~(32)p标记及其检测系统.     

基于通用探针库的实时荧光PCR技术快速检测阳性血培养瓶中的细菌病原体

为从阳性血培养瓶中快速检测8种细菌,选取Roche公司通用探针库的锁核酸探针进行基于实时荧光PCR技术的一组试验。为鉴定菌种根据革兰氏染色的结果,对四组靶向于一个革兰氏阳性菌和一个革兰氏阴性菌的双重实时荧光PCR反应进行优化。检测的灵敏度是1-10CFU(菌落形成单位)/PCR反应混合物。试验的特异性和交叉反应由28个来自于ATCC(美国模式培养物集存库)的参考菌株和77种血培养阴性的标本进行鉴定。在这些试验样品中没有观察到交叉反应,因此证明试验100%的特异性。72种此前鉴定过的临床病毒株通过实时荧光PCR技术进行测试,验证实时荧光PCR试验的精确度和可行性。此外,用实时荧光PCR试验55类阳性血培养样本,通过生化分析评价,50(90.9%)类被鉴定为相同物种。实时荧光PCR与传统的方法有98.2%的一致。实时荧光PCR可以用来作为从阳性血培养中早期检测常见病原体方法的补充。     

基因差异转录表达验证方法研究进展

基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关,随着对组织、器官分化及细胞、生物个体生长发育等的深入研究,大量差异转录基因的验证分析变得越来越重要。为此,该领域基于核酸互补配对和PCR原理建立了Northern blot和荧光定量PCR等一系列基因差异转录分析技术,利用这些方法对不同处理、不同组织器官、不同发育时段的基因差异转录进行了验证分析,为后续的基因功能分析奠定了坚实基础,并且通过检测分析,使基因差异表达分析方法由定性到定量、由繁琐复杂到简单快速、由以大量RNA为前提到对少量RNA样品的检测,甚至建立了单细胞荧光定量PCR方法,基因差异转录验证方法正在向更高效、精准方向发展,并使成本逐步降低。但是,到目前为止,生殖细胞等样品取样较为困难、精子等RNA含量较少样品的基因差异表达验证挑战性还仍然很大。从验证方法发展历程的角度,对基因差异转录验证方法进行了总结,希望为取样难度较大、RNA含量较低样品的基因差异表达分析提供有价值的参考。     

核酸探针中放射性同位素的快速检测

利用尼龙膜作为介质,以0．4mol／L的NaOH为层析液,进行膜上层析,分离经放射性同位素标记的核酸探针和未掺入的放射性游离单核苷酸,再经放射性强度测定即可计算出标记后的核酸探针的放射性比活。方法简单快捷,产生的放射性废物少,完全可以替代经典的三氯乙酸沉淀法及滤膜吸附法。     

荧光基因探针定量PCR诊断试剂盒产业化

中山大学达安基因股份有限公司（以下简称达安公司）是一个以生物学技术为指导的集研究、开发、中试、生产和应用为一体的生物医药高科技企业．目前主营业务为荧光PCR检测技术研究、开发和应用以及荧光PCR检测试剂盒的生产和销售。