人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性

目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的Triton X-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次。洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行最终的纯化。亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性。结果 37℃诱导5 000 m L重组菌p ET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度Triton X-100洗涤包涵体后纯度可达75%。包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40%,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90%。纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好。结论实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定

目的克隆并表达人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株的融合蛋白(F)基因片段。方法利用PCR技术扩增HRSV兰州株的融合蛋白基因片段,克隆于原核表达载体pET-42b(+),转化大肠杆菌(Rosetta),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。结果 PCR扩增得到951 bp的DNA片段,重组质粒pET42b-F经酶切鉴定和测序分析,表明质粒构建正确。表达的重组蛋白的相对分子质量为68 710,表达的重组蛋白占总菌体蛋白的7%,纯化后蛋白纯度达80%。经Western-blot分析,重组蛋白与抗RSV的单抗呈专一性强阳性反应。结论成功构建了HRSV兰州株F基因片段原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta中获得了表达,表达的重组蛋白具有反应原性和特异性,为HRSV感染引起的疾病血清学诊断以及试剂盒的研发提供了材料。     

NK4蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性研究

NK4蛋白是近年来发现的肝细胞生长因子的最佳拮抗剂。为规模化生产NK4蛋白,将NK4基因插入载体pET-26b(+),构建重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并转化大肠杆菌Rosseta（DE3）。转化菌经IPTG诱导后以包涵体形式大量表达重组蛋白,占菌体总蛋白的42%。包涵体用盐酸胍溶解后经Ni NTA树脂亲和层析纯化,蛋白纯度约为95%,经Western blot证实为NK4蛋白。纯化的重组蛋白行稀释复性后可抑制Hela细胞的贴壁、迁徙,并诱导其凋亡,证实制备的NK4蛋白具有生物活性。NK4蛋白的成功制备将有助于NK4相关功能的深入研究。     

大肠杆菌表达托佩克猪SLA-1胞外区的研究

为构建托佩克猪SLA-1重链基因原核重组表达载体并研究其在pET-21a(+)中的表达,设计引物,PCR扩增托佩克猪SLA-1基因胞外区(命名为SLA-1-TPKe),并克隆至pMD19-T Simple Vector,经酶切鉴定后将SLA-1-TPKe基因与表达系统pET-21a(+)连接,转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。提取SLA-1-TPKe包涵体,并经SDSPAGE检测。PCR结果显示,SLA-1-TPKe大小为851 bp,成功克隆到pMD19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为831 bp,连接到pET-21a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为31 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。     

羊传染性脓疱病毒新疆流行株F1L基因克隆及表达

目的:为了探讨F1L重组蛋白作为羊传染性脓疱病毒亚单位疫苗的可行性。方法:以分离出羊传染性脓疱病毒ORFV-shz分离株为模板,扩增F1L基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体中进行测序。构建原核表达载体pET-32a-F1L,转化至大肠埃希菌BL21,用SDS-PAGE及Western blot检测目的蛋白的表达情况及其反应原性。结果:PCR扩增出F1L基因全长1023bp,共编码340个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1～70位氨基酸构成信号肽序列,第285～313位氨基酸为跨膜区。SDS-PAGE分析表明获得了约57.4kDa的融合蛋白,在Western-blotting检测中,融合蛋白可与羊传染性脓疱病毒阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。结论:成功构建F1L基因的原核表达载体,为研究新疆地区羊传染性脓疱的防治及疫苗开发提供了科学依据。     

呼吸道合胞病毒F蛋白研究进展

人类呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F蛋白)为病毒表面结构蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体。因此对F蛋白的深入研究将有助于了解病毒感染的机理,从而为诊断试剂和亚单位疫苗的研制提供帮助。本文就F蛋白结构及结构与功能关系的研究进展进行简要综述。     

嵌合新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒的构建及表达

目的:制备嵌合结肠癌新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒(VLP)。方法:通过重叠PCR将新抗原编码序列插入截短型HBcAg(1～149 aa)第78、79位氨基酸编码序列之间,并将融合基因克隆至原核表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用亲和层析与超滤管纯化浓缩目的蛋白,通过Western印迹、粒径分析与透射电镜成像鉴定嵌合病毒样颗粒。结果:构建了pET-22b(+)重组表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE结果显示在30℃经1 mmol/L IPTG诱导5 h即可获得高浓度的可溶性蛋白,通过亲和层析与超滤浓缩得到了纯度良好的目的蛋白;Western印迹结果表明连有His标签的目的蛋白获得表达且浓度较高;透射电镜成像可见密集的大小均一、空心的球形病毒样颗粒结构。结论:制备出浓度与纯度良好且组装正确的嵌合HBcAg VLP。     

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B催化活性区的原核表达及活性分析

从GenBank获得人PTP1B催化活性区(PTP1Bc)氨基酸序列(1~301aa), 通过重叠PCR获得PTP1Bc基因。构建 pET-22b(+)/PTP1Bc原核表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 阳性重组子IPTG诱导表达, Ni柱纯化蛋白。目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白30%以上。纯化后, 蛋白纯度达95%以上。Western blotting结果表明所得的蛋白可与抗 PTP1B抗体发生特异性结合; 酶活实验证实复性的蛋白具有一定的磷酸酶活性。PTP1Bc基因的构建、表达纯化及活性分析, 为进一步的功能研究奠定了基础。     

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B催化活性区的原核表达及活性分析

从GenBank获得人PTP1B催化活性区(PTP1Bc)氨基酸序列(1~301aa), 通过重叠PCR获得PTP1Bc基因。构建 pET-22b(+)/PTP1Bc原核表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 阳性重组子IPTG诱导表达, Ni柱纯化蛋白。目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白30%以上。纯化后, 蛋白纯度达95%以上。Western blotting结果表明所得的蛋白可与抗 PTP1B抗体发生特异性结合; 酶活实验证实复性的蛋白具有一定的磷酸酶活性。PTP1Bc基因的构建、表达纯化及活性分析, 为进一步的功能研究奠定了基础。     

人偏肺病毒融合蛋白F的原核表达及初步应用

为了探讨人偏肺病毒(hMPV)融合蛋白(F)在原核表达系统中的表达效果及其应用价值,用大肠杆菌表达系统表达hMPV F1亚单位蛋白并用镍柱(Ni-NTA)进行亲和层析纯化,并以其为抗原,用Western Blot方法进行人血清抗体检测的探索。根据F蛋白的疏水性、抗原位点和表面可及性的预测结果选择F1亚单位为目标区域,在大肠杆菌BL21中分别得到了带有6个组氨酸(His)标记的不同基因型hMPV的F1亚单位蛋白的高效表达,目的蛋白大小约37.0 kD,主要以包涵体形式存在。Western Blot检测显示表达的目的蛋白可以特异性地结合抗hMPV的豚鼠多克隆抗体以及确定为hMPV急性感染患者的血清,而且与副粘病毒科肺病毒属的呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV)(2和3型)之间没有交叉反应,显示表达的F1蛋白的特异性和抗原性良好。应用该表达蛋白进行部分人群血清抗体检测的探索,结果显示人群血清抗hMPV-F蛋白的IgG抗体总阳性率约为66%~67%,0~2岁组的血清抗体阳性率随年龄增长呈现逐渐下降趋势,新生儿的抗体阳性率最高,达85%左右,>1岁~2岁组幼儿阳性率最低,提示母传抗体的存在。随后各年龄组人群随年龄的增长血清抗体阳性率逐渐增高,>60岁年龄组人群抗体水平最高,上述结果提示<2岁儿童为hMPV的易感人群。     

A fluorescence polarization assay using an engineered human respiratory syncytial virus F protein as a direct screening platform

Human respiratory syncytial virus (hRSV) typically affects newborns and young children. Even though it can cause severe and, in some cases, lifelong respiratory infections, there are currently no Food and Drug Administration (FDA)-approved therapeutics that control this virus. The hRSV F protein facilitates viral fusion, a critical extracellular event that can be targeted for therapeutic intervention by disrupting the assembly of a postfusion 6-helix bundle (6HB) within the hRSV F protein. Here we report the development of a fluorescence polarization (FP) assay using an engineered hRSV F protein 5-helix bundle (5HB). We generated the 5HB and validated its ability to form a 6HB in an FP assay. To test the potential of 5HB as a screening tool, we then investigated a series of truncated peptides derived from the “missing” sixth helix. Using this FP-based 5HB system, we have successfully demonstrated that short peptides can prevent 6HB formation and serve as potential hRSV fusion inhibitors. We anticipate that this new 5HB system will provide an effective tool to identify and study potential antivirals to control hRSV infection.     

可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备

构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒重组蛋白候选疫苗的质粒构建、表达及免疫原性和保护性研究

PCR扩增呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）M2 蛋白的CD8＋T细胞表位F/M2:81-95和RSV-G蛋白的B细胞表位片段G:125～225（简称G1）,以一个Linker连接,插入质粒pET-DsbA中构建原核表达重组质粒, 转染E.coli BL21(DE3)后成功表达了融合蛋白DsbA-G1-Linker-F/M2:81-95（简称D-G1LF/M2）,Western-blot结果表明该融合蛋白是RSV特异性的,采用Ni+螯合亲和层析法纯化变性的包涵体溶液,经梯度透析法复性,用该蛋白免疫BALB/c小鼠,结果表明被免疫小鼠肺部及血清中产生了高滴度的抗D-G1LF/M2及抗RSV IgG抗体和中和抗体,同时还诱导产生了RSV特异性的CTL应答;IgG的亚型IgG1/IgG2a的比值为2.66;用RSV攻击免疫后的小鼠,病毒滴定法检测肺部RSV滴度,结果表明D-G1LF/M2对小鼠肺部具有保护作用。     

The cytoplasmic tail of the human respiratory syncytial virus F protein plays critical roles in cellular localization of the F protein and infectious progeny production

The importance of the F protein cytoplasmic tail (CT) for replication of human respiratory syncytial virus (HRSV) was examined by monitoring the behavior of viruses expressing F proteins with a modified COOH terminus. The F protein mutant viruses were recovered and amplified under conditions where F protein function was complemented by expression of a heterologous viral envelope protein. The effect of the F protein modifications was then examined in the context of a viral infection in standard cell types (Vero and HEp-2). The F protein modifications consisted of a deletion of the predicted CT or a replacement of the CT with the CT of the vesicular stomatitis virus (VSV) G protein. In addition, engineered HRSVs that lacked all homologous glycoprotein genes (SH, G, and F) and expressed instead either the authentic VSV G protein or a VSV G containing the HRSV F protein CT were examined. We found that deletion or replacement of the F protein CT seriously impaired the production of infectious progeny. Cells infected with viruses bearing CT modifications displayed increased F protein surface expression and increased syncytium formation. The distribution of F protein in the plasma membrane of infected cells was altered, resulting in an F protein that was evenly distributed rather than localized predominantly to virus-induced surface filaments. CT deletion or exchange also abrogated interaction of F protein with Triton-insoluble lipid rafts. Addition of the F protein CT to the VSV G protein, expressed as the only viral glycoprotein in an HRSV genome, had the opposite effects: the number of infectious progeny was higher, the surface distribution was changed from relatively even to localized, and the proportion of VSV G protein associated with lipid rafts was higher. Together, these results show that the HRSV F protein CT plays a critical role in F protein cellular localization and production of infectious virus and suggest that the function provided by the CT is independent of the F protein ectodomain and transmembrane domain and is mediated by F protein-lipid raft interaction.     

腮腺炎病毒F蛋白七肽重复序列的表达、纯化及特性分析

副粘病毒F蛋白的两段七肽重复序列（HR1和HR2）在病毒侵染细胞的过程中相互作用形成热稳定的富含α螺旋的异源二聚体,此结构的形成引起病毒囊膜与细胞膜的并置而最终导致膜融合的发生。腮腺炎病毒（Mumps virus, MuV）属于副粘病毒科,腮腺炎病毒属,可能利用与其他副粘病毒相似的侵染机制。本研究对MuV 融合蛋白的HR区进行了计算机程序预测,并利用大肠杆菌GST融合表达系统对MuV F蛋白HR1和HR2两段多肽进行了表达和纯化,通过GST pull_down 实验证实HR1和HR2多肽在体外能够相互作用,凝胶过滤层析证明HR1、HR2多肽能够形成多聚体,说明MuV F蛋白的HR区的相互作用可能是其发挥融合功能的关键因素。     

转录因子E2F1蛋白纯化及甲基化鉴定

目的:构建人E2F1基因原核表达质粒p GEX-KG-E2F1,并在大肠杆菌中诱导表达。随后验证纯化得到的E2F1蛋白可作为底物被甲基化转移酶修饰。方法:构建原核表达质粒p GEX-KG-E2F1,在大肠杆菌BL-21中经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用GST亲和层析法纯化表达的E2F1蛋白。随后将纯化的E2F1蛋白作为底物,组蛋白甲基化转移酶SET7/9作为酶进行体外同位素标记放射自显影实验,检测纯化的E2F1蛋白能否被甲基化。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体p GEX-KG-E2F1,SDS-PAGE检测结果证明实现了人E2F1基因在大肠杆菌中的可溶性表达,放射自显影证明纯化得到的E2F1蛋白可作为底物被甲基化转移酶SET7/9甲基化。结论:成功构建了转录因子E2F1体外甲基化体系,为筛选新的能甲基化E2F1的酶奠定基础。     

以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的人呼吸道合胞病毒F蛋白DNA 疫苗滴鼻免疫抗体分析

[目的]以减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium aroA strain SL7207,SL7207)为载体携带可表达呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial vrius,RSV)密码子优化的融合蛋白(Fusion glycoprotein,F)的真核表达质粒,探讨不同黏膜免疫途径及密码子优化对免疫效果的影响.[方法]通过对RSV野生型F基因(Fwt)进行密码子优化,获得密码子优化的F基因(Fsyn),并构建可表达Fsyn的真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn,转化SL7207得到SL7207/pcDNA3.1/Fsyn.分别经滴鼻和灌胃途径,免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法比较免疫效果.[结果]与灌胃组相比,滴鼻组诱导小鼠产生了更高水平的血清IgG和黏膜SIgA,获得了更好的免疫效果(P＜0.05).与野生型相比,密码子优化的F蛋白具有更好的免疫原性(P＜0.05).[结论]经滴鼻途径免疫和密码子优化能够提高以SL7207为载体的RSV DNA疫苗免疫效果.